一种乳酸杆菌发酵液的制备方法及其应用与流程

本发明属于化妆品，具体涉及一种乳酸杆菌发酵液的制备方法及其应用。

背景技术：

1、植物花中含有丰富多糖、蛋白质及多酚等功效成分而在化妆品中具有较大应用潜质。植物多糖具有保湿、抗氧化等功效，植物源多肽具有刺激胶原蛋白增生、抗衰老、抗氧化、增强皮肤的活力与弹性等作用。目前，常采用微生物发酵的生物转化的方法提高植物花提取物的抗氧化活性和活性物质总量。但从现有技术看，存在微生物发酵活性低，发酵产物中活性成分浓度低、种类少，对植物花瓣利用不完全等缺陷。另外，在发酵过程中产生的有毒产物，也没有有效的手段进行控制，对发酵产物的使用安全性造成影响。

2、公开号为cn115554226b的中国专利公开一种多重菌株发酵滤液及其制备方法，采用多种益生菌菌株发酵产物组成，通过对不同的花发酵，结果得到的发酵液总酚的含量提高，且使得发酵液的抗氧化活性提高。但是该发酵液在高温下灭菌，会影响活性物质的活性。而且该方法只提取了游离的活性物质，对存在于细胞壁中的活性物质提取不充分。

3、公开号为cn113318037a的中国专利公开了一种提升牡丹花活性成分含量的微生物发酵方法，取新鲜的牡丹花干燥粉碎成牡丹花粉末，接种微生物，然后进行发酵培养，得牡丹花发酵液，制备得到的牡丹花发酵液，牡丹花黄酮和多酚的含量均有明显的提升，抗氧化和美白效果也明显提升。

4、通过微生物的方法能提高总酚和黄酮的含量，在多个专利中都有涉及，但是植物花里含有多糖，萜类，酚类物质，黄酮类物质，花色苷等组分，一部分以游离的形式存在细胞液，另一部分以结合态存在于细胞壁中。如何提取细胞壁中结合态的活性物质，并没有涉及。

5、公开号为cn108245479b的中国专利公开了一种含有乳双歧杆菌发酵活性提取物的面膜，该发明通过优化发酵工艺，并结合科学配比，获得抗敏具有突破性的超越氢化可的松的效果，此外还兼具刺激胶原蛋白再生的效果的面膜。其在发酵阶段加入白酒草皂苷r ,结合其他优化的工艺条件，改变了乳双歧杆菌的生理性能，产生具有极强活性的抗敏作用，促进再生的生物活性的生物多糖等活性物质。但是乳双歧杆菌中胞外多糖的合成可以分为2类，同源多糖的合成和异源多糖的合成。而胞外多糖产量高的菌株，菌株的生长繁殖速度一般较慢，产香能力和酸化能力也一般较弱。同源多糖，如葡聚糖、果聚糖，是在胞外合成的。异源多糖是在细胞膜上合成的。

6、如何能使得不同的多糖都能被较好的被利用，使得细胞壁中结合态的活性物质也能被很好的提取出来，是目前大家关注的热点和急需解决的问题。

技术实现思路

1、为了解决上述问题，本发明的目的在于提出一种乳酸杆菌发酵液的制备方法，以解决现有技术中所存在的一个或多个技术问题，至少提供一种有益的选择或创造条件。

2、针对背景技术中存在的缺陷和不足，本发明提供了一种乳酸杆菌发酵液，以获取高效、安全的花类植物功效原料。该发酵液的总多酚含量和花青素含量高，且成分精简，对肌肤没有刺激性；同时该制备方法能够持久保留各组分的活性，使得活性物质能够稳定存在于发酵液中，起到美白护肤的作用。

3、根据本发明的一方面，首先一种乳酸杆菌发酵液的制备方法采用以质量份数组成和制备工艺：

4、所述质量份数组成主要为：花类10～100份、糖份50～100份和复合乳酸杆菌1～5份；

5、所述的花类是雪莲，樱花，康乃馨，金盏花，桂花，玫瑰，茉莉，山茶花，洋甘菊，薰衣草，兰花，姜花，洛神花一种或多种花。

6、所述乳酸杆菌发酵液的制备工艺是：

7、（1）物料准备：1)将新鲜采摘的花类低温烘干后，粉碎过100目筛，得干花粉末；2）将花粉末加入2～5倍的水混匀后过高压均质机，得花类破壁混合液；

8、（2）将干花破壁混合液、糖份等物料放入发酵桶加入无菌水，在30～40℃的条件下，调ph4.5～5.5，加入乳酸杆菌、纤维素酶、木瓜蛋白酶和果胶酶，发酵过程中应避免阳光照射，并每天用超声波震动棒间隔性超声5次，每次10-30min，发酵7天以上，直至发酵桶内再无新气泡产生，发酵完成；

9、(3)提取发酵液，经固液分离过滤后，即为乳酸杆菌发酵液。

10、所述糖份为果寡糖、大豆寡糖、半乳寡糖、异麦芽寡糖、木寡糖、甘露寡糖、壳寡糖、乳糖醇、异麦芽酮糖一种或多种；

11、用以上方法做出来的乳酸杆菌发酵液，当所用的碳源是木糖或其他非葡萄糖类型的时候，糖份的用量大，且发酵效率明显降低，使得发酵液中的总酚含量和花青素含量提高不明显。

12、1942年jacques monod 首次在大肠杆菌中观察到在混有葡萄糖和乳糖的培养基中，大肠杆菌优先利用葡萄糖进行生长。此后，越来越多的研究表明，在细菌和高等生物中，都存在选择性利用碳源的现象，并且在对模式生物的研究中发现，葡萄糖是绝大多数微生物的优选碳源。通常，葡萄糖的存在会抑制或减少其他次碳源的利用，这种葡萄糖优于其他碳源的现象被称为葡萄糖抑制，葡萄糖抑制应对于微生物在自然环境中的竞争十分重要，因为菌体选择优先利用的碳源是其生长速率高低的主要决定因素，与其能否和其他微生物竞争密切相关。

13、乳酸杆菌是可使葡萄糖等糖类分解为乳酸的各种细菌的总称，乳酸菌是一种无芽孢的杆菌，属革兰氏阳性菌，单个、成双或短链排列；厌氧性呼吸，乳酸杆菌有较强的代谢碳水化合物产酸能力，可以合成葡聚糖和杂多糖，能使糖类发酵产生乳酸或其他酸类物质，现有乳酸杆菌在发酵生长的过程中对碳源的要求较高，故而使得其在生产过程中对外加碳源的用量较大，不仅得生产成本过高，其会使大量植物花遭到浪费，故而提出一种乳酸杆菌复合发酵菌种组合以解决上述问题。

14、植物花的细胞壁主要由纤维素、半纤维素和木质素的异质复合物组成。纤维素是葡萄糖的聚合物，而半纤维素是葡萄糖和戊糖的杂聚物，如木糖和阿拉伯糖。木质素是交联苯丙烷单元的聚合物复合物。因此，植物花可以提供多种糖，如葡萄糖、木糖等，可以被作为碳源为微生物所利用，但是又因为葡萄糖抑制效应，使得植物花作为提供多糖的碳源，利用极不充分，不能有效提取细胞壁里结合态的活性物质。葡萄糖的存在会抑制天然转运蛋白对其他糖类的摄取，从而限制了混合碳源中多糖的利用效率。

15、因此，在发酵中植物花的木质素、纤维素和半纤维素都可以转化成十分宝贵的能源。纤维素组成之间的碳碳键断裂从而被降解为葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、甘露糖等单糖和纤维二糖等寡糖，生成了多糖混合液。作发酵原料时，产生的技术难题是微生物对其中各种糖类的高效利用。

16、除了提高微生物对植物花细胞壁中各种糖类的高效利用，我们另一个作用，就是提高总酚含量和花青素的含量。不同乳酸杆菌对花青素的降解程度不同，例如cano-lamadrid等人报道了用干酪乳杆菌和保加利亚乳杆菌发酵富含石榴的牛奶后，花青素含量高于其他乳杆菌属。与植物乳杆菌或短乳杆菌相比，鼠李糖乳杆菌或副干酪乳杆菌更显着地降低发酵橙汁中花青素的含量。

17、微生物的生长主要是吸收花细胞中的蛋白和多糖类物质进行生长，因此发酵也可以对花细胞中有效成分进行浓缩，从而达到富集的目的。往往植物花中的活性物质比较复杂，都具有一定的毒素，从而影响鲜花的功效。目前的毒素去除方法主要是通过化学方法实现，但是化学方法具有操作繁琐、成本高等缺点。而微生物可以通过代谢减少花细胞中的毒性物质或者转化为无毒物质。因此需要选择一种菌液，既能提高花细胞中多糖的高效利用，减少发酵过程中额外添加的碳源，又能通过代谢将花细胞中的有毒物质转化为无毒低毒物质。

18、乳酸杆菌因其存在葡萄糖抑制效应，同时对水解液中的代谢抑制物比较敏感，当水解液中的葡萄糖含量达到5g/l，乳杆菌的生长就因水解液中的抑制物受到抑制，冷凝芽孢杆菌和大肠杆菌虽然能够同时利用水解液中的葡萄糖和木糖，但是当水解液中的木糖含量分别达到 35g/l和15g/l时，其生长就因水解液中的抑制物而受到阻遏。虽然存在利用其他天然糖的生物体，如丝状真菌、梭状芽孢杆菌、古细菌等，但它们在很大程度上缺乏成熟的遗传工具或表现出低产品和抑制剂耐受性。由于葡萄糖抑制的存在，在有葡萄糖等优先碳源存在的情况下，乳酸杆菌利用其它次碳源的能力受到抑制，除了造成碳源利用效率低下。还会产生一系列的问题，如菌体生长严重受阻、葡萄糖利用障碍、影响代谢产物的生成等等问题。进而使得整个发酵时间拉长，发酵转化率降低。同时，还需要采用一些活性物质，来激活代谢中产生的组氨酸酶，当酶处于被激活状态时，可以解除葡萄糖抑制效应。因此，为了解除葡萄糖效应，同时对水解液的抑制物具有一定抗性的菌株，本发明提供一种乳酸杆菌复合发酵菌种组合，该组合能提高发酵效率，并利用微生物将植物花作为营养来源的主要底物，将细胞壁里的多糖转化成醇类、脂类、萜类等人体容易吸收的小分子营养物质。

19、首先，通过三种乳酸杆菌的复配菌，具体为所述的复合乳酸杆菌为乳酸乳杆菌、嗜酸乳杆菌、双岐杆菌的组合，重量比为（1.0-3.5）：（0.2-0.3）：（1.0-3.0）；

20、进一步地，制备等电位为4.0的小分子活化液和复合乳酸杆菌液，具体步骤为：

21、s001，在装有搅拌桨、温度计、冷凝器的反应釜中，将明胶加入去离子水中在30～40℃下加热搅拌 30～50分钟至明胶完全溶解，得到凝胶状的明胶溶液；

22、s002，继续升温到80～90℃下，并快速搅拌,搅拌速度为500～800rpm，继续反应30～50分钟，水解得到小分子活性基团，冷却到20～30℃下，加入柠檬酸，调节ph为5.0-5.3，

23、s003,加入谷氨酸，继续反应30～50分钟，调整小分子活化液的等电点，使其等电点从原来的5.2变成4.0，停止搅拌，静止30～50分钟，溶液中的小分子活性基团成为带负电荷的小分子活性微粒，该溶液记为小分子活化液。

24、所述的明胶重量份数为5～8份，所述的柠檬酸重量份数为0.5～2份，所述的谷氨酸重量份数为1.0～2.5份。

25、进一步地，将复合菌种和小分子活化液反应，形成带负电荷的乳杆酸菌微球分散在活化液中，得到复合菌液。

26、s004，将小分子活化液温度控制在15～20℃下，加入复合乳酸杆菌，乳酸杆菌是一种特别容易吸附负电荷的菌种，搅拌30～50分钟，混合均匀，乳酸杆菌被吸附在带负电荷的小分子活性微粒周围，形成了带负电荷的乳杆酸菌微球被分散在小分子活化液中，得到富含负电荷的乳杆酸菌微球的复合菌液，记为复合乳酸杆菌液。这种带电荷的乳杆酸菌能均匀分散在小分子活化液中。

27、多酚根据存在形式又可分为结合酚和游离酚。大多数游离态酚类物质位于植物细胞的液泡中，一般不与其他的大分子发生物理、化学相互作用，可以用传统的方法提取出来。结合态多酚位于植物细胞的细胞壁基质中。在细胞内器官，主要是内质网中合成的酚类化合物通过囊泡转移系统释放并转运到液泡或细胞壁基质中，被运输的酚类化合物通过细胞壁基质中的醚、酯和碳碳键结合到大分子如结构蛋白、纤维素和果胶上，形成不溶性结合态酚类化合物，普通的有机溶剂无法高效地提取这类结合态多酚，必须借助其它技术使其水解释放出来。作为细胞壁主要成分的纤维素，它使细胞壁具有一定程度的机械强度，从而也限制了细胞壁中酚类化合物的释放。且大量研究表明，游离酚的抗氧化能力强于结合酚。因此促进结合酚向游离酚的转化将成为多酚更好被吸收利用的有效途径。如果想释放结合酚，需要一些其他技术加以辅助分泌一些胞外酶，将细胞壁组分与酚类相结合的共价键破坏掉，纤维素等物质都能被很快的降解，破坏细胞壁的结构，让酚类物质能脱离细胞壁的束缚，从而被释放出。

28、进一步地，为了加速细胞壁的降解，为乳酸杆菌发酵提供更多的底物，增加营养成分的含量，需要各种酶的促进。纤维素酶的作用表现在两个方面 ：一是可使纤维素分解产生葡萄糖，为乳酸菌发酵提供更多的底物 ；二是加速细胞壁的降解，增加营养成分的含量。纤维素酶中含有氧化还原酶成分，可以消耗氧气，从而更容易创造厌氧环境。但是纤维素酶只能分解部分的多聚葡萄糖，对位于植物细胞的细胞壁基质中的结合态多酚却无能为力。

29、进一步地，对鲜花进行处理得到含有低分子量的β-葡聚糖的破壁混合液，具体步骤为：

30、s101,将新鲜采摘的花类低温烘干后，粉碎过100目筛，得干花粉末；将花粉末加入2～5倍质量份的去离子水混匀后过高压均质机，得花类破壁混合液；

31、所述的花类是雪莲，樱花，康乃馨，金盏花，桂花，玫瑰，茉莉，山茶花，洋甘菊，薰衣草，兰花，姜花，洛神花一种或多种花；所述的高压均质条件是：压力为60～80mpa。

32、s102,在装有搅拌桨、温度计、冷凝器的反应釜中，温度20～30度，加入花类破壁混合液，加入β-葡聚糖酶，加入柠檬酸，搅拌2～3小时，促进破壁液中的多聚葡萄糖提前水解，得到低分子量的β-葡聚糖，含有低分子量的β-葡聚糖的破壁液记为低分子量的β-葡聚糖的破壁液。

33、进一步地，对低分子量的β-葡聚糖的破壁液进行发酵，最终得到乳酸杆菌发酵液，具体制备方法为：

34、s201，将含有低分子量的β-葡聚糖的破壁液、糖份物料放入发酵桶加入去离子水，高压灭菌后，在30～40℃的条件下，调ph4.5～5.5，加入复合乳酸杆菌液、纤维素酶，发酵过程中应避免阳光照射，并每天用 超声波震动棒间隔性超声5～8次，每次10～30min，发酵24小时；

35、所述糖份为果寡糖、大豆寡糖、半乳寡糖、异麦芽寡糖、木寡糖、甘露寡糖、壳寡糖、乳糖醇、异麦芽酮糖一种或多种；

36、s202，加入小分子活化液，柠檬酸钠，在30～40℃下，用 超声波震动棒30～50min；

37、当ph为4.5～5.5时，高于等电位，小分子活化液带正电荷，局部ph迅速下降到3左右，此时附近小分子活化液因为小于等电位，进行转化带负电荷，在正负电荷的作用下，分子运动加剧，尤其是当带了负电荷的乳杆酸菌微球会产生定向吸附，吸附在细胞壁上的纤维素和半纤维素，由于异性相吸的电荷作用，很容易和带了正电荷的活化液分子相碰撞，而活化液分子中是负载了氨基酸的小分子活性物质，纤维素和半纤维素和活化液小分子活性物质的碰撞机会越多，反应机会越多，反应速度越快，产生了大量的脂肽分子。

38、s203, 再加入根类提取物，进行二次发酵，在30～40℃的条件下，并每天用 超声波震动棒间隔性超声5～8次，每次10～30min，发酵3～4天，直至发酵桶内再无新气泡产生，发酵完成；

39、s204，提取发酵液，经固液分离过滤后，即为乳酸杆菌发酵液。

40、首次发酵时，作为纤维素中的多聚葡萄糖，首先成为发酵中可利用的能量，并且在发酵中被进一步水解为葡萄糖，而生成的低分子量的β-葡聚糖的破壁液更进一步地，能使得在乳酸菌发酵过程代谢的过程中，产生大量的羧酸酯水解酶，而羧酸酯水解酶能够水解植物细胞壁中如阿拉伯木聚糖和其他多糖之间的酯键，释放出游离的酚酸类物质还具有较高的抗氧化性。并且它可以与其它纤维素酶共同作用于植物细胞壁，通过复合酶协同作用可有效降解鲜花细胞壁组分，与此同时发酵液中的低分子量的β-葡聚糖还可以保护皮肤的有益菌种而抑制皮肤的有害菌种，起到维持面部菌群平衡的功效。

41、加入小分子活化液，进行二次发酵，发酵液中开始产生了大量的脂肽分子，其中的脂肪酸链为亲脂基，多肽链则为亲水基。是羟基脂肪酸和多肽链以酰胺键或者内脂的形式结合成环状脂肽，这些环状脂肽细胞壁结合，并作用于细胞壁的脂双层结构，形成离子通道从而破坏细胞壁，不仅如此，我们还发现补充加入钾离子、钠离子或镁离子可以加速引起细胞膜电位的变化，进一步促进解除葡萄糖抑制效应。使得细胞充分利用次碳源恢复生长。除了环状脂肽导致膜电位信号的变化，添加阳离子一样可导致菌株细胞膜电位的变化，激活组氨酸激酶。进一步导致迅速解除葡萄糖抑制效应，菌种开始利用细胞壁里纤维素，半纤维素的其他多糖结构，作为细胞壁主要成分的纤维素，半纤维素，它使细胞壁具有一定程度的机械强度，现在作为次碳源进行进一步降解，被限制在细胞壁中的酚类化合物开始释放。通过细胞壁基质中的醚、酯和碳碳键结合到大分子蛋白、纤维素和果胶上的结合酚，随着纤维素和半纤维素的降解，游离出来更多的游离酚，溶解在发酵液中。与此同时，水解得到的葡萄糖，果糖，与加入小分子活化液中的氨基发生加成反应，通过对氮原子上的非共享电子对攻击羰基碳原子，生成环状酮分子，使得总酚类的含量进一步提高。

42、所加的β-葡聚糖酶占物料重量比的0.1～0.2份，其酶活≥8万u/g，所加柠檬酸为1～2份，所加的纤维素酶占物料重量比的0.1～0.2份，其酶活≥7万u/g；所述的低分子量的β-葡聚糖的破壁液200份～500份、糖份5～10份，复合乳酸杆菌液80～110份，所述的小分子活化液是10～20份，柠檬酸钠是1～2份，所述的根类提取物5～10份，所述的根类提取物是人参根提取物，苦参根提取物和牡丹根提取物一种或以上；其中人参根提取物占物料重量比的0～5份，苦参根提取物占物料重量比0～5份，牡丹根提取物占物料重量比0～5份。

43、所述超声棒的超声提取条件是，间隔时间为0.5～4h，频率为20～25khz，输出功率30～80w。

44、虽然提高碳源浓度，可以提高发酵效率，大大减少发酵时间，那为什么这里我们反而特别限制碳源的量呢，一方面是因为限制碳源可以减少成本，可以激发发酵过程中更多利用花类底物里本身含有的纤维素和半纤维素作为次碳源能源，另一方面也是因为当碳源浓度较高时，发酵所产的醇含量较高，会抑制了菌种生长，从而使其对破壁液中的花青素转化速度变慢，转化率也降低。相对来讲，在整个发酵过程中，当含糖量从5%增加到25%，其花青素含量从38.2 mg/l下降到26.4 mg/l，下降幅度明显。因此我们将外加的糖粉控制在5～10份。

45、与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

46、1.本发明预先将复合乳酸杆菌、小分子活化液混合均匀，得到富含负电荷的乳杆酸菌微球的复合菌液，通过电荷运动保证发酵原料的均匀性，使得乳酸杆菌能充分接触到细胞壁中的纤维素和半纤维素，保证为发酵提供充分的能量，而且复合乳酸杆菌为乳酸乳杆菌、嗜酸乳杆菌、双岐杆菌的组合，重量比为（1.0-3.5）：（0.2-0.3）：（1.0-3.0）时，这种组合明显提高发酵效率，使发酵周期从10天缩短到5天，加速微生物细胞的生长，同时促进有益代谢产物的合成。

47、2、本发明通过植物乳杆菌、嗜热链球菌、青春双岐杆菌、长双岐杆菌的组合作为复合乳酸菌液，并与酶的产生协同效应，初次发酵中产生大量有益的酶，并在二次发酵中激活解除葡萄糖抑制效应的酶。与此同时增加的小分子活化液，使得与初次发酵产物进行反应，加速细胞壁的降解，为乳酸杆菌发酵提供更多的底物，增加营养成分的含量，提升了植物花有益成分的溶出和转化，同时促进益生菌的代谢产物的产生，使功效发酵液具有较好的功效性能，使得细胞壁中的结合酚转化为游离酚，提高了二次发酵液中总酚和花青素的含量，比普通方法得到的花青素与总多酚的含量分别提升21%和19%以上。

48、3.本发明充分利用花类细胞壁中的纤维素和半纤维素中的多糖物质作为能量，减少90%的糖粉用量，减少其他的碳源的引入，也更加促进了花类细胞壁的非葡萄糖次碳源的利用，使得细胞壁里的多糖结构被降解成游离酮，游离有机酸和花色苷，提升了发酵液的抗氧化活性。并通过发酵降低了其花类原有的毒副作用，得到更安全的花类化妆品原料。

49、4.本发明采用30～40℃的发酵温度和4.5～5.5的发酵ph，发酵条件温和，植物活性成分结构不被破坏，避免了提取方法造成的活性成分流失。并且是以植物花为原料通过多种复合乳酸杆菌液发酵得到，制备原料安全、环保，制备工艺安全、可控，制备的发酵液是无色或淡黄色澄清透明液体，具有花的发酵乳香。应用于化妆品中能提供良好的羟自由基和dpph·自由基清除能力，发挥优秀的抗氧化美白功效。复配根类提取物能达到修复、维护皮肤菌群平衡的功效。