一株枯草芽孢杆菌及其菌剂、发酵饲料和预混料的制作方法

本发明属于生物，筛选到一株能够高产果胶酶和抑制副溶血弧菌物质的枯草芽孢杆菌，与复合中草药配伍发酵后，制备成发酵虾料和预混料，应用在水产养殖领域。

背景技术：

1、南美白对虾(litopenaeus vannamei)原产于美洲太平洋沿岸海域，1988年7月由中科院海洋研究所从美国夏威夷引入我国，目前已经成为我国主要的养殖品种之一。据中国渔业统计年鉴(2023)显示，2022年我国南美白对虾养殖产量达到209.8万吨，其中海水养殖规模达到134万吨，淡水达到75.8万吨。中国对虾的养殖主要分布在中国东部沿海地区，包括广东、广西、海南、福建、浙江、江苏、山东、天津等地。养殖模式包括池塘养殖、高位塘养殖、小棚虾养殖、鱼虾混养等多种方式。

2、江苏沿海地区主要以小棚虾养殖模式为主，集中于如东、大丰、射阳等地，目前亩产达到700-1250kg左右，有力的推动了当地水产养殖业的发展，带动了农户致富。江苏小棚虾养殖模式目前已推广到山东、福建、广东、广西等地。

3、目前对虾的高密度养殖面临着水质氨氮、亚硝酸盐超标、弧菌病害多发、偷死等诸多挑战，造成病害多发、养殖成功率低等诸多困难。为了提高养殖成功率，在养殖过程中大量使用抗生素。抗生素的过量使用造成耐药菌株的出现，使养殖业面临着更大的风险。

技术实现思路

1、为解决上述问题，本发明从江苏如东小棚虾养殖区域筛选到一株枯草芽孢杆菌，该菌能够显著抑制弧菌生长。在对虾发酵饲料的使用过程中，能够显著提高添加复合中药的药效，提高饲料利用率、降低饵料系数，并能减少养殖环境中弧菌数量，提高对虾养殖成功率，降低养殖风险，增加养殖收益。

2、首先，本发明提供一株能够抑制弧菌的枯草芽孢杆菌新菌株yp-1。

3、本发明所提供的枯草芽孢杆菌分离自江苏如东地区南美白对虾养殖水域。在光学显微镜下其营养细胞呈现长杆状，在菌体的中间或端部能够观察到膨大的芽孢。在lb培养基中培养24h后，菌落呈现淡黄色，半透明状、边缘清晰，无褶皱。菌体革兰氏染色呈现阳性。

4、本发明筛选到的枯草芽孢杆菌能够代谢合成果胶酶，发酵液中18h时的产果胶酶能力达到3234.2u/ml，具有生长速度快、产酶能力高的特点。

5、通过抑菌实验发现本发明筛选到的枯草芽孢杆菌能够有效抑制对虾养殖水体中的副溶血弧菌。在养殖过程中定期使用，能够有效控制养殖水体中的弧菌数量。

6、利用细菌的通用引物对筛选到的菌株进行pcr鉴定：按细菌dna提取试剂盒操作说明书提取模板dna。使用16s rrna保守序列的上游引物5'-agagtt tga tcc tgg ctc ag-3’和下游引物5’-ggt tacctt gtt acg act t-3’扩增细菌16s rrna基因片段。经过测序得到该菌属于枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)，命名为yp-1扩增片段的测序结果见seq idno.1。

7、利用lb培养基：胰蛋白胨10/l，酵母提取物5g/l，nacl 10g/l，培养所筛选到的枯草芽孢杆菌yp-1，检测其发酵液中代谢产物对副溶血弧菌的抑制效果。将发酵液加注到培养好副溶血弧菌的tcbs的牛津杯中，观测到明显的抑菌圈。

8、将筛选到的枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)命名为yp-1，于2023年11月21日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为：cgmcc no.29086。

9、本发明还提供该枯草芽孢杆菌的一种高密度发酵培养基，其含有kh2po4 0.8～1.5g/l，大豆蛋白胨10～15g/l，糖蜜3～6g/l，feso4 0.5～0.8g/l，mgso4 2.5～3.5g/l，氯化钠10～15g/l，消泡剂0.05～0.1％，初始ph7.0～7.5。

10、本发明还提供一种抑制对虾养殖环境中弧菌数量的发酵饲料制备方法，其发酵产物中含有枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)cgmcc no.29086。按照10～20％的饲喂比例能够有效降低对虾的饵料系数0.05～0.15。

11、本发明还提供另外一种含有枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)cgmcc no.29086的预混料，其含有枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)cgmcc no.29086的菌粉，其添加量为0.5～1‰。

12、其中，所述的菌粉制备方式如下：将高密度发酵液利用碟式离心机浓缩3～5倍后，添加10～15％可溶性玉米淀粉作为载体，进行喷雾干燥，干燥条件为：进风温度160～200℃，出口温度80～90℃，进料速度10～12l/min，雾化转头速度18000～25000r/min，制备成含枯草芽孢杆菌活菌数量为1010～1011cfu/g菌粉。

13、本发明的开发的的对虾发酵饲料按照10～20％的比例配伍使用虾料，能够有效控制养殖水体中弧菌浓度、提高对虾的饲料吸收利用率，提高生长性能并能增强免疫力。

技术特征：

1.一株枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)新菌株yp-1，其保藏号为cgmcc no.29086，其具有产果胶酶能力和抑制副溶血弧菌生长的能力。

2.如权利要求1所述的枯草芽孢杆菌，其16s rna基因序列如seq id no.1所示。

3.如权利要求1所述的枯草芽孢杆菌的高密度发酵培养基，其含有kh2po4 0.8～1.5g/l，大豆蛋白胨10～15g/l，糖蜜3～6g/l，feso4 0.5～0.8g/l，mgso4 2.5～3.5g/l，氯化钠10～15g/l，消泡剂0.05～0.1％，初始ph7.0～7.5。

4.如权利要求1和权利要求3所述枯草芽孢杆菌的高密度发酵培养液，1～3％接种于南美白对虾虾料中，按照如下配方比例：虾料800～1000kg，枯草芽孢杆菌发酵液10～30l，粪肠球菌菌粉1～3kg，布拉迪酵母菌粉0.5-1kg，复合中草药粉3～5kg，甘露聚糖肽0.5～1kg。

5.如权利要求4所述复合中草药粉配方比例：辣寥草800～150g、马齿苋100～150g、山楂150～200g、青蒿20～50g、甘草50～100g、黄芪120～180g、山药100～300g、青皮20～40g、厚朴20～40g、槟榔10～20g、肉桂20～40g、丁香10～30g、大茴10～20g、迷迭香10～20g。

6.如权利要求4所述的对虾发酵料置于带单项呼吸阀的密封袋中，30℃发酵3～7天，制备成活菌总数＞109cfu/g的发酵饲料。发酵饲料中枯草芽孢杆菌：粪肠球菌：布拉迪酵母活菌数量比例为：80～100∶5～10∶10～20。

7.如权利要求6所述发酵虾料按照10～20％的配比配合虾料使用，降低南美白对虾饵料系数0.05～0.15。

8.如权利要求3所述的枯草芽孢杆菌发酵液制备成菌粉，其特征在于，所述的菌粉制备方式如下：将高密度发酵液利用碟式离心机浓缩3～5倍后，添加10～15％可溶性玉米淀粉作为载体，进行喷雾干燥，干燥条件为：进风温度160～200℃，出口温度80～90℃，进料速度10～12l/min，雾化转头速度18000～25000r/min，制备成含枯草芽孢杆菌活菌数量为1010～1011cfu/g菌粉。

9.如含权利要求1和权利要求8制备的菌粉添加到预混料，具有提高饲料转化效率作用。其预混料配方按照下述比例：枯草芽孢杆菌菌粉0.5～1‰，复合中药粉1-3％，甘露聚糖肽0.5～1.5‰。

技术总结
本发明属于生物技术领域，提供一株枯草芽孢杆菌()，其保藏号为CGMCC No.29086。其特征在于所述的枯草芽孢杆菌能够高产果胶酶，并能抑制副溶血弧菌的生长。本发明还提供所述的枯草芽孢杆菌及其在发酵饲料和预混料中的应用。本发明筛选到的高产果胶酶的枯草芽孢杆菌，配伍甘露聚糖肽和黄芪等中草药，能够显著抑制副溶血弧菌的生长、改善对虾肠道健康，提高对虾发酵饲料在水产养殖中的应用效果。本发明还提供包含所述枯草芽孢杆菌经液体深层发酵后制备的菌粉制备的核心预混料，能够提高产品的应用性能。

技术研发人员：付维来,周孝东,齐志涛,张显,吴山功,饶志明
受保护的技术使用者：江苏月鹏科技集团有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/4/22