一种双示踪聚苯乙烯纳米小球的合成方法

本发明属于生物标记，具体为一种双示踪聚苯乙烯纳米小球的合成方法。

背景技术：

1、纳米塑料(nanoplastic)指金属、非金属和有机填充物以纳米尺寸(一般指1～100nm)分散于聚合物基体中形成的聚合物基纳米复合材料。在聚合物基纳米复合材料中，加入的填料分散相为纳米材料，其尺寸至少在一维方向上小于100nm。尽管在实地研究中测量纳米塑料仍在取得进展，但在中试规模研究中研究纳米塑料的命运、运输和生物相互作用和/或影响的研究人员可以利用完全不同的方法。这些研究方法中，有用示踪剂掺杂颗粒可能是跟踪由于低浓度、高自然背景阻碍而难以分析的颗粒的有效方法，例如使用钯(pa)等环境背景中低且成本不高的元素进行作为金属示踪探针，利用电感耦合的方法进行元素追踪；或者通过制作荧光标记探针分子对纳米塑料进行定性标记，能直观的观察到纳米塑料在不同介质中的分布情况。

2、然而，据我们所知，目前鲜有关于在动植物体中nps的吸收动力学和内部运输的定量信息，尽管这些信息是评估纳米塑料对环境的影响和对人类健康的潜在危害的关键。因此这反映出迫切需要开发新的方法，以便准确追踪纳米塑料，并为解释观察到的生物反应提供基础。

3、许多研究试图追踪荧光颗粒，例如表面功能化的ps纳米颗粒作为纳米塑料的模型。然而，这种技术有许多缺点，包括高检测限和荧光背景信号的干扰，这是使用传统荧光技术可视化纳米塑料的普遍挑战。此外，荧光允许定性但不准确的定量测量，并且受到许多外部因素的极大影响，包括氧化，散射和漂白。并且大多数显微成像技术只允许在纳米到微米尺度上对部分生物组织进行定性研究。近年来放射性同位素技术最近已成功用于定量研究环境相关浓度下塑料纳米颗粒的命运，不过由于处理放射性物质所涉及的危险，它们的适用性有限。因此，一种方便且具有成本效益的放射性标记替代方案，允许定量测量生物分布，可以使研究陆地生物吸收和易位塑料颗粒的研究人员更容易获得量化技术。

技术实现思路

1、本发明的目的在于针对现有技术中存在的问题，提供一种双示踪聚苯乙烯纳米小球的合成方法。通过该方法可以得到用于通过电感耦合等离子体质谱以及荧光光度计两种方法定量检测ps纳米小球。该方法首次采用稀土有机配合物作为检测探针，具体是通过合成恒温水浴的方法合成稀土有机配合物，并且利用丙酮和二氯甲烷作为溶胀剂，将稀土有机配合物包裹至ps纳米小球内，并通过离心洗涤的方式得到纯净的ps-eu悬浮液。这种方法充分利用了高分子有机聚合物的溶胀原理，通过包裹的方式解决了eu元素附着在材料表面稳定性差的问题，同时较小的影响ps纳米小球的表明性能。

2、为了实现以上发明目的，本发明采用的具体技术方案为：

3、一种双示踪聚苯乙烯纳米小球的合成方法，其包括以下步骤：

4、s1、苯乙烯的预处理；

5、将苯乙烯经过预处理，得到纯化后的苯乙烯；

6、s2、ps纳米小球悬浊液的制备：

7、将乙醇与去离子水加入三口烧瓶中，再加入s1中纯化后的苯乙烯并通氩气鼓泡，磁力搅拌一段时间；随后加入2,2-偶氮二(2-甲基丙基咪)二盐酸盐作为引发剂，继续搅拌并升温反应，得到ps纳米小球悬浊液；

8、s3、eu(tta)3phen的合成：

9、将三氯化铕与2-噻吩甲酰三氟丙酮按比例加入乙醇中，随后配制菲啰啉溶液，并逐滴加入至eucl3和tta的混合溶液中，得到白色絮状体；接着将得到的物质进行离心并撇去上清液，随后再用乙醇洗涤沉淀多次以除去杂质，并对洗涤后的沉淀进行冷冻干燥，得到了发光铕配合物eu(tta)3phen，保存在4℃冰箱中备用；

10、s4、eu(tta)3phen掺入ps小球中：

11、取s2中制备的ps纳米小球悬浊液，并将这些悬浊液分散至含有eu(tta)3phen的丙酮和二氯甲烷混合溶液中，在室温下搅拌一段时间后，继续通过搅拌去除溶液中的丙酮，得到聚苯乙烯纳米小球悬浊液；将聚苯乙烯纳米小球悬浊液进行离心，随后用去离子水和乙醇分别交替清洗，得到纳米粒子；最后将得到的纳米粒子通过超声波重新分散到水中，得到荧光与稀土元素eu标记的ps纳米小球，缩写为ps-eu。

12、作为本技术中一种较好的实施方式，因为苯乙烯很容易发生自聚，因此，购得的苯乙烯试剂中常常会带有阻聚剂。故制备前需先进行预处理将其纯化。s1中苯乙烯的预处理步骤为：取10ml苯乙烯放置与分液漏斗中，同时配置质量浓度为5％的naoh和1mol·l-1的na2co3清洗液100ml，将这100ml溶液分5次每次与分液漏斗中的苯乙烯进行混合并摇匀2min，撇去多余的清洗液后再加入同样浓度的清洗液20ml，如此反复进行5次，直至苯乙烯溶液呈现淡黄色为止。除去阻聚剂后将其倒入至棕色试剂瓶中并放置在4℃冰箱中保存备用。

13、作为本技术中一种较好的实施方式，s2 ps纳米小球悬浊液的制备步骤为：按照醇水比例3:2的标准将165ml与110ml的去离子水加入至500ml的三口烧瓶中，再加入10ml纯化后的苯乙烯并通氩气鼓泡(防止合成过程中氧气的氧化作用)，在1200rpm的转速下磁力搅拌0.5h。随后加入引发剂2,2-偶氮二(2-甲基丙基咪)二盐酸盐(aiba)作为引发剂，继续搅拌并升温至70℃，反应8h。

14、作为本技术中一种较好的实施方式，s3eu(tta)3phen的合成步骤为：将0.1mmol的三氯化铕(eucl3)与0.3mmol的2-噻吩甲酰三氟丙酮(tta)按照浓度比1:3的比例加入至20ml乙醇中，随后配制10mmol的1,10菲啰啉溶液10ml，并逐滴加入至eucl3和tta的混合溶液中，得到白色絮状体。将得到的液体进行离心并撇去上清液，随后再用乙醇洗涤沉淀三次以除去杂质，并对洗涤后的沉淀进行冷冻干燥，得到了发光铕配合物eu(tta)3phen，保存在4℃冰箱中备用。

15、作为本技术中一种较好的实施方式，s4eu(tta)3phen掺入ps小球中的具体步骤为：将前述合成后的ps纳米小球悬浊液62.5ml，并将这些悬浊液分散至含有10mg eu(tta)3phen的40ml丙酮和0.1ml二氯甲烷混合溶液中，在室温下搅拌24h后，继续通过在60℃下搅拌24h的方式去除溶液中的丙酮。

16、将反应完后的聚苯乙烯(ps)纳米小球悬浊液在14000rpm转速下离心15min，随后用去离子水和乙醇分别交替清洗3次。将得到的纳米粒子通过超声波重新分散到100毫升水中，得到荧光与稀土元素eu标记的ps纳米小球，缩写为ps-eu(即双示踪聚苯乙烯纳米小球)。

17、作为本技术中一种较好的实施方式，在s1步骤中，naoh和na2co3的混合溶液是作为纯化剂的，naoh和na2co3的浓度分别为1.25mol·l-1和1mol·l-1，每次清洗阻聚剂时聚苯乙烯与纯化剂的体积比为1:2。

18、作为本技术中一种较好的实施方式，s2步骤中，聚苯乙烯与引发剂质量比为2％。

19、作为本技术中一种较好的实施方式，本发明中，浓度为99％苯乙烯溶液作为单体，所用单体不含稳定剂；三氯化铕粉末作为稀土溶质，纯度高达99.9％；丙酮掺杂二氯甲烷作为溶胀剂，丙酮与二氯甲烷的体积比为400:1。

20、本技术的另外一个发明目的是保护采用以上方法或可替换的步骤的组合制备得到的双示踪聚苯乙烯纳米小球。

21、进一步的，该双示踪聚苯乙烯纳米小球的粒径在200nm左右、表面均匀且稳定。

22、本技术的第三个发明目的是保护所述的双示踪聚苯乙烯纳米小球的应用，该双示踪聚苯乙烯纳米小球用于通过电感耦合等离子体质谱或荧光光度计定量检测ps的方法中。

23、通过电感耦合等离子体质谱(icp-ms)鉴定和定量生物样品中纳米塑料的一种有希望的方法，这个方法涉及用金属元素掺杂塑料。其中镧系元素螯合物具有明显的优势，因为它们具有较长的发光寿命、较大的斯托克斯位移、清晰的发射曲线和可见光激发波长。因此镧系元素可作为有效的荧光分子探针进行使用；不仅如此镧系元素螯合物在塑料颗粒中的截留可能是通过icp-ms定量镧系金属间接进行定量，即使在低浓度下也是可行的。

24、因此本发明通过该方法制备出一种粒径在200nm左右、表面均匀且稳定并可以通过荧光和电感耦合两种方法进行追踪的双示踪纳米聚苯乙烯小球，为后续研究纳米塑料在环境或植物体中的毒理性实验打下基础。

25、与现有技术相比，本发明的积极效果体现在：

26、传统的材料标记方法为在均相反应器中通过自聚的方法形成类似核壳结构并具有标记的材料，或者利用负载接枝的方法将材料标记于表面。这些方法均存在反应复杂、材料不稳定且副产物多等问题。考虑到有机高分子聚合物存在分子溶胀效应，因此本研究利用聚苯乙烯的这种特性对其进行信号标记。

27、(1)该合成方法使用到有机高分子聚合物物质溶胀的性质，通过聚合物溶胀的方法将荧光标记包裹进聚合物内，这种方法不损害聚苯乙烯纳米小球表面性质和内部结构，同时也防止荧光标记在环境中降解而导致荧光效果出现差异的情况；

28、(2)所选用的荧光标记分子为稀土元素有机配合物，稀土元素铕(eu)具有金属和荧光性双重性质，即在监测方法上可同时采取两种方法：利用其荧光性可用荧光光度计监测或者利用其金属性使用电感耦合(icp)法进行监测，两种监测方法可以相互印证。

29、(3)在监测方法上，传统的荧光或者金属探针均存在不足之处：荧光探针多为可降解有机物，容易被环境降解；同时荧光光度计仅能从定性或者半定量上分析环境中纳米塑料的存在情况；金属探针对环境金属背景值的要求较高，需要环境背景中基本不存在该金属的环境；同时要考虑到金属毒性是否会对环境产生其他负面影响。荧光+金属的双示踪探针eu(tta)3phen不仅对环境影响相对较小，同时不易降解，其荧光特性可以用于环境中的成像追踪，金属特性可用于精准定量监测。