用于血浆外泌体miRNA检测的内参基因的制作方法

本发明涉及基因工程领域，特别是涉及用于血浆外泌体mirna检测的内参基因。

背景技术：

1、micrornas(即mirnas)是一类由内源基因编码的长度约为21-24个核苷酸的非编码单链rna分子，参与包括细胞增殖、凋亡、分化、代谢等几乎全部的生理和病理全过程。目前，mirna已经成为肿瘤、心血管疾病、自身免疫性疾病等多种疾病的诊断、监控和预后的重要的生物标志物。

2、外泌体是指包含了复杂rna和蛋白质的小膜泡(30-150nm)，现特指直径在40-100nm的盘状囊泡，存在于血液、唾液、尿液、脑脊液和乳汁等天然体液中。一般情况下，细胞在正常及病理状态下均可分泌外泌体，其主要来源于细胞内溶酶体微粒内陷形成的多囊泡体，经多囊泡体外膜与细胞膜融合后释放到胞外基质中。近年来的研究表明，外泌体作为特异性分泌的膜泡，可通过其携带的蛋白质、核酸、脂类等来调节受体细胞的生物学活性，参与细胞间通讯，影响各个生理和病理过程。

3、外周血是临床上比较容易得到的样本，而血浆是很多研究的对象。现有的血浆外泌体mirna检测技术有定量pcr、数字pcr、基因芯片、二代测序等技术，而最为常见的还是定量pcr和数字pcr。然而，目前尚未有用于血浆外泌体mirna检测的稳定内参，一些用于组织、细胞mirna的内参在血浆外泌体中均不太稳定。将mirna作为生物标志物的检测标准化，使检测过程可在任何实验室重复是非常必要的。血浆外泌体mirna检测的稳定内参的缺乏，制约着血浆外泌体mirna研究的深入以及不同实验阶段研究成果的比较。

技术实现思路

1、基于上述缺点，本发明第一方面提供hsa-mir-181a-5p和/或hsa-mir-451a作为内参基因在mirna检测或制备mirna检测产品中的用途。

2、所述内参基因还包括hsa-mir-221-3p、hsa-mir-16-5p、u6、u48、gadph、β-actin中的一种或多种。

3、所述内参基因包括以下任一项或多项：

4、1)hsa-mir-181a-5p；

5、2)hsa-mir-451a；

6、3)hsa-mir-221-3p和hsa-mir-181a-5p；

7、4)hsa-mir-221-3p和hsa-mir-451a；

8、5)hsa-mir-181a-5p和hsa-mir-16-5p；

9、6)hsa-mir-181a-5p和hsa-mir-451a；

10、7)hsa-mir-16-5p和hsa-mir-451a。

11、所述mirna检测的适用样本选自以下中任一种或多种：血液、体液、细胞、外泌体、组织、器官，优选的，所述外泌体为血浆外泌体。

12、本发明第二方面提供内参基因检测物在mirna检测或制备mirna检测产品中的用途，所述内参基因为上述第一方面的用途中的内参基因。

13、所述内参基因检测物选自引物、探针、适配体或抗体。

14、所述内参基因检测物包括以下任一项或多项：

15、1)检测hsa-mir-181a-5p的引物，核苷酸序列包含seq id no.5所示的序列；

16、2)检测hsa-mir-451a的引物，核苷酸序列包含seq id no.6所示的序列；

17、优选的，所述内参基因检测物还包括以下任一项或多项：

18、3)检测u6的引物，核苷酸序列包含seq id no.1所示的序列；

19、4)检测u48的引物，核苷酸序列包含seq id no.2所示的序列；

20、5)检测hsa-mir-16-5p的引物，核苷酸序列包含seq id no.3所示的序列；

21、6)检测hsa-mir-191-5p的引物，核苷酸序列包含seq id no.4所示的序列；

22、7)检测hsa-mir-221-3p的引物，核苷酸序列包含seq id no.7所示的序列；

23、8)检测has-mir-126-3p的引物，核苷酸序列包含seq id no.8所示的序列。

24、本发明第三方面提供一种mirna检测产品，所述产品中包括检测内参基因的物质，所述检测内参基因的物质包括检测上述第一方面的用途中的内参基因的物质。

25、所述mirna检测产品的适用样本选自以下中任一种或多种：血液、体液、细胞、外泌体、组织、器官，优选的，所述外泌体为血浆外泌体。

26、所述检测内参基因的物质选自引物、探针、适配体或抗体。

27、所述检测内参基因的物质包含以下一项或多项：

28、1)检测u6的引物，核苷酸序列包含seq id no.1所示的序列；

29、2)检测u48的引物，核苷酸序列包含seq id no.2所示的序列；

30、3)检测hsa-mir-16-5p的引物，核苷酸序列包含seq id no.3所示的序列；

31、4)检测hsa-mir-191-5p的引物，核苷酸序列包含seq id no.4所示的序列；

32、5)检测hsa-mir-181a-5p的引物，核苷酸序列包含seq id no.5所示的序列；

33、6)检测hsa-mir-451a的引物，核苷酸序列包含seq id no.6所示的序列；

34、7)检测hsa-mir-221-3p的引物，核苷酸序列包含seq id no.7所示的序列；

35、8)检测has-mir-126-3p的引物，核苷酸序列包含seq id no.8所示的序列。

36、本发明第四方面提供一种非诊断目的的mirna检测方法，其特征在于，所述方法包括使用上述第一方面的用途中的一项或多项内参基因作为内参检测样本mirna，或使用上述第二方面的用途中的内参基因检测物，或使用上述第三方面的mirna检测产品检测样本mirna。

37、本发明的有益效果在于：

38、本发明的内参基因在血浆外泌体中稳定表达，其稳定值优于现有的内参基因u6和u48，本发明提供的mirna检测产品具有较高的灵敏度，可对血浆外泌体中的mirna进行检测。使用本发明的内参基因或mirna检测产品可以通过qpcr或者ddpcr用于mirna检测中目标基因的标准化，可以实现不同实验阶段研究结果的比较，促进各实验结果的归一化处理。

技术特征：

1.hsa-mir-181a-5p和/或hsa-mir-451a作为内参基因在mirna检测或制备mirna检测产品中的用途。

2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述内参基因还包括hsa-mir-221-3p、hsa-mir-16-5p、u6、u48、gadph、β-actin中的一种或多种。

3.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述内参基因包括以下任一项或多项：

4.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述mirna检测的适用样本选自以下中任一种或多种：血液、体液、细胞、外泌体、组织、器官，优选的，所述外泌体为血浆外泌体。

5.内参基因检测物在mirna检测或制备mirna检测产品中的用途，所述内参基因为权利要求1～4任一项所述用途中的内参基因。

6.如权利要求5所述的用途，其特征在于，所述内参基因检测物选自引物、探针、适配体或抗体。

7.如权利要求5所述的用途，其特征在于，所述内参基因检测物包括以下任一项或多项：

8.一种mirna检测产品，其特征在于，所述产品中包括检测内参基因的物质，所述检测内参基因的物质包括检测权利要求1～4任一项所述用途中的内参基因的物质。

9.根据权利要求8所述mirna检测产品，其特征在于，所述mirna检测产品的适用样本选自以下中任一种或多种：血液、体液、细胞、外泌体、组织、器官，优选的，所述外泌体为血浆外泌体；

10.根据权利要求8所述mirna检测产品，其特征在于，所述检测内参基因的物质包括以下任一项或多项：

11.一种非诊断目的的mirna检测方法，其特征在于，所述方法包括使用权利要求1-4任一项用途中的一项或多项内参基因作为内参检测样本mirna，或使用如权利要求5-7任一项所述用途中的内参基因检测物，或使用如权利要求8-10任一项所述mirna检测产品检测样本mirna。

技术总结
本发明提供hsa‑miR‑181a‑5p和/或hsa‑miR‑451a作为内参基因在miRNA检测或制备miRNA检测产品中的用途，所述内参基因还包括hsa‑miR‑221‑3p、hsa‑miR‑16‑5p、U6、U48、GADPH、β‑actin中的一种或多种。本发明还提供一种miRNA检测产品，所述产品中包括检测上述内参基因的物质。使用本发明的内参基因或miRNA检测产品可以通过qPCR或者ddPCR用于miRNA检测中目标基因的标准化，实现不同实验阶段研究结果的比较，促进各实验结果的归一化处理。

技术研发人员：徐祎春,袁箐,韩峻松,产天龙,孟家旭,段靖轩,李倩,欧莹,李曼婧
受保护的技术使用者：上海生物芯片有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/3/24