一种检测荔枝霜疫霉病病菌用的引物组及其在制备试剂盒中的应用的制作方法

本发明涉及分子检测，尤其涉及植物病害的分子检测技术。

背景技术：

1、荔枝霜疫霉病是由荔枝霜疫霉菌(peronophythora litchii)引起荔枝(litchichinensis)最重要的病害之一。目前，福建、广东、广西、海南等地均有病害发生，主要危害近成熟的果实，也可危害叶片、花穗及幼果，严重时引起大量落果和烂果，产量损失可达30％～80％，严重影响荔枝的产量、品质，对鲜果贮运和外销不利。

2、传统的培养及鉴定方法对荔枝霜疫霉病的检测，需要耗费大量的培养时间，且操作人员需要具备专业的病原菌鉴定知识和丰富的经验才能保证检测鉴定的准确性，大大限制了检测效率。

3、公开号为cn107058609a的中国专利申请《一种荔枝霜疫霉pcr引物及其分子检测方法》公开了一种荔枝霜疫霉pcr引物及其分子检测方法，专用于荔枝霜疫霉特异检测，主要采用一种荔枝霜疫霉菌的pcr引物(plrhf：ctcgaaaggctaatccgaatg；plrhr：acggcactcttcaggctctt)经过聚合酶链式反应扩增后琼脂糖凝胶电泳检测，可观察到大小为340bp左右的单一形带。所发明的pcr引物及其用法可被用于生产实践中荔枝霜疫霉菌感染的植株和采摘后荔枝果实中荔枝霜疫霉菌的快速、灵敏、准确的检测，同时可用于田间病害的早期诊断和病菌的监测和鉴定，为荔枝霜疫霉菌引起的病害防治提供可靠的技术和理论依据。但是该技术的灵敏度仅达到100pg/μl基因组，折算约1×103copies/μl。灵敏度水平还是不能满足检测要求。

4、荧光定量pcr技术以其高灵敏度、高特异性、高检测效率等优点，成为转基因、流行病学筛查、动物疫病检测等领域的主流检测方法。引入荧光定量pcr技术检测荔枝霜疫霉病，可大幅减少检测时间，同时检测操作简单，结果直接明了，大大降低了对操作人员的病原菌鉴定水平要求。因此，一种能够实现对荔枝霜疫霉病病菌进行快速、高灵敏度准确检测的方法，能极大满足我国的农产品与食品中荔枝霜疫霉病检测的需要，是具有重大意义的。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种检测荔枝霜疫霉病病菌的引物组及其在制备试剂盒中的应用，以解决现有技术中缺乏针对荔枝霜疫霉病进行快速、高灵敏度准确检测技术的问题。

2、为了达到上述目的本发明采用如下技术方案：

3、本发明提供一种检测荔枝霜疫霉病的引物组，包括：正向引物litchi1-f，其序列如seq id no.1所示；反向引物litchi1-r，其序列如seq id no.2所示；探针litchi1-p，其序列如seq id no.3所示；

4、所述探针5’端修饰有荧光基团，3’端修饰有淬灭基团。

5、进一步地，所述荧光基团为fam基团，所述淬灭基团为bhq1基团。

6、本发明还提供一种所述检测荔枝霜疫霉病病菌的引物组在制备检测试剂或试剂盒中的应用。

7、本发明还提供一种含有所述检测荔枝霜疫霉病病菌的引物组的试剂盒，包括所述引物组、pcrbuffer、taq dna聚合酶、udg酶、阴性对照、阳性对照。

8、当然，试剂盒中会附上说明书，用于叙述试剂盒的使用场景及具体步骤。所述试剂既可以预分装在pcr管中，也可以保存在棕色管中。

9、优选地，所述阴性对照是超纯水，保存在0.5ml的保存管之中。

10、优选地，所述阳性对照是含有靶标序列的重组质粒，所述阳性对照的重组质粒浓度为10-100pg/μl，保存在0.5ml的保存管之中。

11、优选地，所述重组质粒是由靶标序列插入含有ampicillin抗性的载体上制得，靶标序列如seq id no.4所示。

12、本发明还提供含有所述引物组的荔枝霜疫霉病检测用的反应体系，所述反应体系共25μl，成分包括pcr buffer、0.04～0.06u/μl taq dna聚合酶、0.01～0.04u/μl udg酶、0.2～0.6μm所述的正向引物、0.2～0.6μm所述的反向引物、0.05～0.3μm所述的探针，待测核酸添加体积5μl，余量为超纯水。

13、更优地，所述pcr buffer成分包括45～55mmol/l kcl、8～12mmol/l tris-hcl、1.4～1.6mmol/lmgcl2、90～110μg/ml牛血清白蛋白(bsa)、dntp各190～210μmol/l。

14、更优地，taq dna聚合酶的浓度为0.05u/μl，udg酶的浓度为0.01u/μl，所述的正向引物0.4μm，所述的反向引物0.4μm，所述的探针0.2μm。

15、本发明还提供应用所述反应体系的荔枝霜疫霉病病菌检测方法，步骤包括：

16、(1)提取待测样品核酸；

17、(2)构建所述的反应体系；

18、(3)分别加入阳性对照、阴性对照及待测样品核酸后，在实时荧光定量pcr仪上按如下程序进行pcr反应：去污染，50℃，5分钟，1个循环；预变性，95℃，5分钟，1个循环；扩增，95℃，15秒，60℃，30秒，40个循环；荧光采集；

19、(4)根据扩增曲线及ct值判断待测样品核酸是否含有荔枝霜霉病病菌。

20、本发明的有点包括：灵敏度高，可达1×101copies/μl(0.1fg/μl)，比普通pcr高出100倍数；检测效率高，扩增时间约60min，无需电泳步骤。

技术特征：

1.一种检测荔枝霜疫霉病病菌的引物组，其特征在于：

2.根据权利要求1所述的一种检测荔枝霜疫霉病病菌的引物组，其特征在于：

3.一种如权利要求1或2所述检测荔枝霜疫霉病病菌的引物组在制备检测试剂或试剂盒中的应用。

4.一种含有权利要求1或2所述检测荔枝霜疫霉病病菌的引物组的试剂盒，其特征在于：

5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于：

6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于：

7.一种含有权利要求1或2所述引物组的荔枝霜疫霉病病菌检测用的反应体系，其特征在于：

8.根据权利要求7所述的荔枝霜疫霉病病菌检测用的反应体系，其特征在于：

9.根据权利要求7所述的荔枝霜疫霉病病菌检测用的反应体系，其特征在于：

技术总结
本发明公开了一种检测荔枝霜疫霉病病菌用的引物组及其在制备试剂盒中的应用，试剂盒包括所述引物组、PCR buffer、Taq DNA聚合酶、UDG酶、阴性对照、阳性对照，检测方法步骤包括：提取待测样品核酸、构建反应体系，按反应程序进行反应，结果判读。本发明优点包括：具有较高的特异性和灵敏度、检测结果准确可靠。

技术研发人员：张璜,余嘉明,常彦磊,郭秋霞,林梦蝶
受保护的技术使用者：广州双螺旋基因技术有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/4/7