一种快速分离纯化植物细胞核的方法

本发明涉及植物分子细胞生物学，尤其涉及一种快速分离纯化植物细胞核的方法。

背景技术：

1、虽然蛋白质组学、转录组组学以及突变体或者群体筛选等研究策略在研究植物信号感知、转导和下游基因响应机制中发挥着要作用，但是，另一个重要的问题是高等植物的不同类型细胞对于信号的感知和响应具有细胞特异性，因此对于多细胞类型的植物组织而言，这种研究策略往往会忽略不同类型细胞在响应激素或者环境信号时的细胞异质性问题，进而掩盖各个细胞类型专一性的信号感知、转导与下游调控基因，这也是目前植物功能基因鉴定和深入解析植物信号转导途径的重要限制因素，因此，如何以高分辨率方式呈现植物细胞类型专一性的信号转导与下游响应机制成为植物生物学与作物科学研究中的一个高精尖课题，植物细胞类型专一性信号转导与下游响应机制的深入解析可以将植物科学研究带入一个全新的高精度时代，进而为作物分子育种提供精准的理论指导。

2、近年来，单细胞高通量测序技术在医学领域、模式动植物及农业科学领域已经得到广泛应用，极大的提升了人类对于诸多生命发育过程和疾病的理解，单细胞高通量测序技术避免了细胞异质性对于细胞类型特异调控信息的掩盖，将医学科学以及生命科学研究带入了一个精准靶向分析时代。

3、单细胞rna测序技术(scrna-seq)在植物中的应用，提高了人们对拟南芥、水稻、玉米、棉花、花生和杨树等植物物种细胞异质性的认识(zhang tq,xu zg,shang gd,wangjw.a single-cell rna sequencing profiles the developmental landscape ofarabidopsis root.mol plant,2019,12(5):648-660；zhang tq,chen y,liu y,lin wh,wang jw.single-cell transcriptome atlas and chromatin accessibility landscapereveal differentiation trajectories in the rice root.nat commun,2021,12(1):2053；ortiz-ramírez c,guillotin b,xu x,rahni r,zhang s,yan z,coqueiro diasaraujo p,demesa-arevalo e,lee l,van eck j,gingeras tr,jackson d,gallagher kl,birnbaum kd.ground tissue circuitry regulates organ complexity in maize andsetaria.science,2021,374(6572):1247-1252；qin y,sun m,li w,xu m,shao l,liu y,zhao g,liu z,xu z,you j,ye z,xu j,yang x,wang m,lindsey k,zhang x,tul.single-cell rna-seq reveals fate determination control of an individualfibre cell initiation in cotton(gossypium hirsutum).plant biotechnol j,2022,20(12):2372-2388；liu h,hu d,du p,wang l,liang x,li h,lu q,li s,liu h,chen x,varshney rk,hong y.single-cell rna-seq describes the transcriptome landscapeand identifies critical transcription factors in the leaf blade of theallotetraploid peanut(arachis hypogaea l.).plant biotechnol j,2021,19(11):2261-2276；li h,dai x,huang x,xu m,wang q,yan x,sederoff rr,li q.single-cellrna sequencing reveals ahigh-resolution cell atlas of xylemin populus.jintegr plant biol,2021,63(11):1906-1921)，在拟南芥、水稻和玉米中，根细胞类型已经得到了很好的分析(zhang tq,xu zg,shang gd,wang jw.a single-cell rna sequencingprofiles the developmental landscape of arabidopsis root.mol plant,2019,12(5):648-660；zhang tq,chen y,liu y,lin wh,wang jw.single-cell transcriptomeatlas and chromatin accessibility landscape reveal differentiationtrajectories in the rice root.nat commun,2021,12(1):2053；ortiz-ramírez c,guillotin b,xu x,rahni r,zhang s,yan z,coqueiro dias araujo p,demesa-arevaloe,lee l,van eck j,gingeras tr,jackson d,gallagher kl,birnbaum kd.groundtissue circuitry regulates organ complexity in maize and setaria.science,2021,374(6572):1247-1252)，利用scrna-seq技术可以比较水稻和拟南芥根系的转录组异质性，结果表明，水稻中存在厚壁组织和外表皮两种特殊的细胞群，而拟南芥中不存在，在稻田中，厚壁组织和外表皮可以阻止水稻根系径向氧损失(zhang tq,chen y,liu y,linwh,wang jw.single-cell transcriptome atlas and chromatin accessibilitylandscape reveal differentiation trajectories in the rice root.nat commun,2021,12(1):2053)，单子叶植物的根分化与双子叶植物的根分化不同，单子叶植物的侧根冠和表皮不同于双子叶模式物种拟南芥那样具有共同的起始细胞(zhang l,he c,lai y,wang y,kang l,liu a,lan c,su h,gao y,li z,yang f,li q,mao h,chen d,chen w,kaufmann k,yan w.asymmetric gene expression and cell-type-specific regulatorynetworks in the root of bread wheat revealed by single-cell multiomicsanalysis.genome biol,2023,24(1):65)，单细胞转录组测序(scrna-seq)能够重建细胞分化轨迹，对器官发育研究提供新视角，水稻胚根的scrna-seq揭示了外表皮、厚壁组织和皮层的分化轨迹，结果表明这些地面组织起源于相同的分生组织细胞群(zhang tq,chen y,liu y,lin wh,wang jw.single-cell transcriptome atlas and chromatinaccessibility landscape reveal differentiation trajectories in the riceroot.nat commun,2021,12(1):2053)，scrna-seq研究还可以深化我们对基因功能的认知，ortiz-ramírez等人证明了转录因子short-root的迁移对于玉米皮层的分裂是必需的(ortiz-ramírez c,guillotin b,xu x,rahni r,zhang s,yan z,coqueiro dias araujop,demesa-arevalo e,lee l,van eck j,gingeras tr,jackson d,gallagher kl,birnbaum kd.ground tissue circuitry regulates organ complexity in maize andsetaria.science,2021,374(6572):1247-1252)。

4、将单细胞转录组rna测序技术应用于作物科学研究的主要瓶颈在于植物细胞存在细胞壁结构，这导致了植物原生质体细胞分离困难，分离时间延长不仅会导致得到的植物细胞原生质体中死细胞比率上升，还会增加植物细胞原生质体转录调控时间的延迟效应，不能够实时准确的表征植物细胞对于外界刺激的即时信号转导及转录响应，已有研究开始将单细胞核测序技术应用于拟南芥根尖的单细胞转录组测序分析(long y,liu z,jia j,mo w,fang l,lu d,liu b,zhang h,chen w,zhai j.flsnrna-seq:protoplasting-freefull-length single-nucleus rna profiling in plants.genome biol,2021,22(1):66)，单细胞核转录组测序分析已经在动物及疾病研究中得到应用(ding j,adiconis x,simmons sk,kowalczyk ms,hession cc,marjanovic nd,hughes tk,wadsworth mh,burkst,nguyen lt,kwon jyh,barak b,ge w,kedaigle aj,carroll s,li s,hacohen n,rozenblatt-rosen o,shalek ak,villani ac,regev a,levin jz.systematiccomparison ofsingle-cell and single-nucleus rna-sequencing methods.natbiotechnol,2020,38(6):737-746)，这是因为细胞核相较于原生质体而言更加稳定，而且细胞核内rna可以更加准确反映细胞内部即时的转录调控事件，避免了rna剪接体剪接及rna转运过程带来的转录后调控延迟效应(shaw r,tian x,xu j.single-celltranscriptome analysis in plants:advances and challenges.mol plant,2021,14(1):115-126)，更重要的是，细胞核可以在固定溶液及冷冻环境下较为稳定的存在，因此，在作物发育及环境响应研究中可以将处理好的样品通过快速冷冻而将细胞核内的转录调控事件固定在特定时间点，进一步避免酶解液消化植物组织材料所引起的转录调控延迟效应。已有研究在小麦根中进行了单细胞核转录组测序(snrna-seq)，该研究在单细胞分辨率下探索了亚基因组之间不对称基因表达模式，构建细胞类型特异的基因表达调控网络(zhang l,he c,lai y,wang y,kang l,liu a,lan c,su h,gao y,li z,yang f,li q,maoh,chen d,chen w,kaufmann k,yan w.asymmetric gene expression and cell-type-specific regulatory networks in the root of bread wheat revealedby single-cell multiomics analysis.genome biol,2023,24(1):65)，而且，更多的单细胞高通量测序技术主要是以细胞核为基础开展的，包括单细胞核转录组测序(snrna-seq)、单细胞染色质可及性测序(scatac-seq)、单细胞全基因组甲基化测序(scwgbs)、单细胞chip-seq(scchip-seq)和单细胞cut&tag测序(sccut&tag)(zhang l,he c,lai y,wang y,kang l,liu a,lan c,su h,gao y,li z,yang f,li q,mao h,chen d,chen w,kaufmann k,yanw.asymmetric gene expression and cell-type-specific regulatory networks inthe root of bread wheat revealed by single-cell multiomics analysis.genomebiol,2023,24(1):65；farlik m,sheffield nc,nuzzo a,datlinger p,a,klughammer j,bock c.single-cell dna methylome sequencing and bioinformaticinference of epigenomic cell-state dynamics.cell rep,2015,10(8):1386-97；raimundo f,prompsy p,vert jp,vallot c.a benchmark ofcomputational pipelinesfor single-cell histone modification data.genome biol,2023,24(1):143；wu sj,furlan sn,mihalas ab,kaya-okur hs,feroze ah,emerson sn,zheng y,carson k,cimino pj,keene cd,sarthy jf,gottardo r,ahmad k,henikoff s,patel ap.single-cell cut&tag analysis of chromatin modifications in differentiation andtumorprogression.nat biotechnol,2021,39(7):819-824)。

5、通常情况下，基于细胞核的单细胞高通量测序首先需要分离和纯化细胞核，并使得细胞核维持在游离分散的状态，目前较为常用的单细胞纯化方法主要借助于流式细胞分选仪(zhang l,he c,lai y,wang y,kang l,liua,lan c,su h,gao y,li z,yang f,li q,mao h,chen d,chen w,kaufmann k,yan w.asymmetric gene expression and cell-type-specific regulatory networks inthe root of bread wheat revealed bysingle-cell multiomics analysis.genome biol,2023,24(1):65)，一台较好的、高效的流式细胞分选仪价格至少在300-400万之间，价格昂贵，而且流式细胞分选仪使用步骤较为复杂，通常一两个单细胞测序样品的流式分选过程就需要1个小时以上的计时，包括仪器的开机、校准、上机测试、分选、清洗和关机等操作步骤，耗时较长，流式细胞分选仪器的操作流程繁复，维护成本较高，仪器操作技术水平要求较高，通常需要专业人员负责和指导，这极大限制了单细胞核测序样本的制备过程和样品数目，尤其是经过流式分选后富集的细胞核状态不稳定，容易引起细胞核破裂和聚集，分选和富集后的细胞核需要尽快完成单细胞上机工作，否则就会导致实验失败。以上这些因素极大直接限制了许多实验室和公司的相关单细胞测序工作的开展。

6、在前期的单细胞核分离和纯化研究工作中，我们发现使用特殊的试剂，就可以在相对较低离心力就可以富集到大量细胞核，而且经过2-3次的洗涤，可以去除线粒体和叶绿体等细胞质成分，但离心所获得的细胞核纯度较低，依然会含有部分细胞壁碎片，我们发现经过几种不同孔径大小的细胞筛依次过滤和离心富集后，可以快速的富集得到大量高纯度的、处于游离分散的细胞核，细胞核形态完整，没有破裂和聚集，也就是说，使用改进后的细胞核分离和富集方法所得到的细胞核状态非常稳定，可以保存相对较长的时间，该方法的优点在于：(1)摒弃了对价格昂贵的流式细胞分选仪的过度依赖，操作步骤快速、简明易懂，不需要专业人员负责仪器运行和维护，节约细胞核制备过程中的时间成本和人力成本；(2)流式细胞分选仪的使用机时费用在300-400元/小时，节约了细胞核制备过程中的机时费用；(3)低离心力富集获得的细胞核较为完整，游离细胞核状态十分稳定，可以保存两个小时以上，非常适用于基于单细胞核的高通量测序研究，而经过流式分选后得到的细胞核容易发生细胞核破裂和聚集，需要尽快完成后续的上机操作，时间较为紧张，不适用于制备多个样本。

技术实现思路

1、本发明要解决的技术问题是建立一种快速、高效的高纯度植物细胞核分离纯化方法，摒弃以往高纯度植物细胞核分离过程中对流式分选细胞仪的依赖，从而降低植物细胞核分离、纯化的时间成本、人力成本和昂贵仪器使用成本，同时提高所分离和富集得到细胞核的完整性和稳定性，长时间维持细胞核的游离状态，以便于进行基于单细胞核的高通量测序研究。

2、为了达到上述目的，本发明提供了以下技术方案：

3、本发明提供了一种植物细胞核分离试剂r缓冲液，所述r缓冲液试剂包括：0.4m甘露醇，20mm柠檬酸钠(ph＝7.0)，20mm氯化钾，40mm氯化镁，0.2％聚乙二醇辛基苯基醚，3mm二硫苏糖醇，1％牛血清蛋白。

4、本发明提供了植物细胞核分离试剂r缓冲液在粗分离植物细胞核中的应用。

5、本发明提供了试剂r缓冲液粗分离植物细胞核的方法，包括以下步骤：

6、a.向冰上预冷后的60mm的无菌平皿中加入400μl的r缓冲液，然后将1克植物叶片在r缓冲液中浸润，使用双面刀片在r缓冲液中将植物幼叶切至匀浆状态；

7、b.再次向无菌平皿中加入400μl的r缓冲液，轻轻水平摇晃平皿1分钟，使得细胞膜充分裂解，释放出细胞核；

8、c.将裂解后的植物幼叶匀浆悬液依次经过35μm和20μm的细胞筛过滤，去除匀浆中的残渣，使用1.5ml的离心管收集滤液；

9、d.再次向平皿中加入400μl的r缓冲液，冲洗平皿后，将收集的滤液转移至35μm和20μm的细胞筛上进行过滤和收集。

10、本发明提供了一种植物细胞核纯化试剂rdt缓冲液，所述rdt缓冲液试剂包括：0.4m甘露醇，20mm柠檬酸钠(ph＝7.0)，20mm氯化钾，40mm氯化镁，3mm二硫苏糖醇，1％牛血清蛋白。

11、本发明提供了试剂rdt缓冲液纯化植物细胞核的方法，包括以下步骤：

12、(1)粗分离植物细胞核，并收集分离后的细胞核悬液；

13、(2)使用rdt缓冲液和8μm的过滤筛网过滤纯化植物细胞核；

14、(3)使用rdt缓冲液洗涤纯化植物细胞核。

15、进一步地，步骤(2)中，所述使用rdt缓冲液和8μm的过滤筛网过滤纯化植物细胞核的具体步骤包括：

16、e.将收集的细胞核悬液离心，在100g，4℃下离心6分钟，然后轻柔缓慢地弃去上清液，并在管底保留30-40μl上清液；

17、f.使用700μl的rdt缓冲液重悬细胞核沉淀，然后将重悬后的细胞核悬液转移至8μm的过滤筛网进行冰上过滤和收集；

18、g.将收集的细胞核悬液离心，在100g，4℃下离心6分钟，然后轻柔缓慢地弃去上清液，并在管底保留30-40μl上清液。

19、进一步地，步骤(3)中，所述使用rdt缓冲液洗涤纯化植物细胞核的具体步骤包括：

20、h.使用700μl的rdt缓冲液重悬细胞核沉淀，将重悬后的细胞核悬液再次离心，在100g，4℃下离心6分钟，然后轻柔缓慢地弃去上清液，并在管底保留30-40μl上清液；

21、i.重复步骤h一次；

22、j.使用管底余留的上清液重悬细胞核沉淀，加入2μl 2mg/ml的4',6-二脒基-2-苯基吲哚染液，于冰上避光染色5分钟，荧光显微镜镜检。

23、通常细胞核的离心富集所使用的离心力在500-1000g之间，在某一个特定的实施例中，使用d缓冲液作为细胞核分离试剂，采用差异离心方法沉淀和去除较大的组织碎片和杂质，以期在后续的离心富集过程中得到较高纯度的细胞核，根据离心富集的结果发现，100g低速离心所得沉淀重悬后，就可以将大部分细胞核和组织碎片从细胞核悬液中沉淀出来，这明显不同于以往细胞核离心富集时所采用的较高离心力，因此后续继续探索如何在100g左右的低速离心条件下富集到更加高纯度的细胞核。

24、鉴于d缓冲液离心富集所得到的细胞核悬液中存在较多的组织碎片，本发明另一个特定的实施例中，在使用d缓冲液分离水稻细胞核后，使用孔径更小的20μm的细胞筛过滤分离得到的细胞核，以期可以去除较多的组织碎片，结果显示，低速离心富集得到的细胞核悬液中依然还有较多组织碎片，且有一定程度的细胞核聚集现象，为此，后续更换细胞核分离缓冲液配方，以期减少细胞核聚集现象。

25、c缓冲液是另外一种在拟南芥中使用的细胞核分离缓冲液，在某一个特定的实施例中，使用c缓冲液在100g离心力下富集水稻细胞核，结果显示，c缓冲液引起的细胞核聚集现象明显弱于d缓冲液，但还是会有一定的组织碎片残留。

26、为了进一步减少细胞核聚集的现象，本发明在d缓冲液和c缓冲液的基础上创新了一种新的细胞核分离试剂，被命名为r缓冲液，在某一个特定的实施例中，使用r缓冲液在100g离心力下富集水稻细胞核，结果显示，r缓冲液分离后的细胞核没有明显的聚集现象，大部分细胞核呈现出游离的单核状态，但是还是会有一定的细胞壁碎片残留，需要进一步优化r缓冲液分离细胞核的具体操作方法，以便于进一步去除细胞壁碎片和杂质。

27、由于在100g离心力条件下，以上所述各种细胞核分离缓冲液富集到的细胞核均含有一定的组织或细胞壁碎片，而且细胞核直径较小，因此，在某一个特定的实施例中，采用更小孔径的8μm细胞筛过滤去除较大的组织或细胞壁碎片，结果显示，使用r缓冲液分离所得到的细胞核，经过8μm细胞筛过滤后，可以得到非常纯净且处于游离状态的细胞核，未观察到细胞核聚集现象。

28、鉴于上述细胞核分离缓冲液中均含有去污剂聚乙二醇辛基苯基醚，聚乙二醇辛基苯基醚作为一种温和的表面活性剂，其在细胞核分离过程中可以使细胞膜破裂释放出细胞核，并可以使得细胞核与细胞质中的内质网等结构分离，虽然聚乙二醇辛基苯基醚对细胞核核膜的完整性的破坏作用很弱，但是细胞核长时间储存在含有聚乙二醇辛基苯基醚的缓冲液中，也有引起细胞核核膜受损的风险。在某一个特定的实施例中，将前期使用的r缓冲液中的聚乙二醇辛基苯基醚去除，并把用来进行后期细胞核纯化的、去除聚乙二醇辛基苯基醚的缓冲液命名为rdt缓冲液，以进一步确保后期纯化过程中细胞核核膜的完整性，使得细胞核可以在相对较长时间内保持稳定的游离状态，避免细胞核破裂和聚集。

29、本发明的有益效果：本发明所提供的适用于植物细胞核分离和纯化的试剂配方所使用的试剂为实验室常规试剂，可以较好的维持植物细胞核的完整性和游离状态，该试剂还可以长期低温保存使用，不需要现用现配；本发明所提供的细胞核分离纯化方法，不需要依赖于昂贵的仪器设备，操作快速、安全，只需要一台低温离心机、几种不同孔径的细胞筛和若干常用耗材即可。