一株野百合碱单克隆抗体杂交瘤细胞株及其应用

本发明涉及免疫化学，尤其是指一株野百合碱单克隆抗体杂交瘤细胞株及其应用。

背景技术：

1、野百合碱(monocrotaline，mct)又称猪屎豆碱或农吉利甲素，是从豆科植物农吉利及大叶猪屎青中提取出来的生物碱，是一种具有肝毒性、肾毒性以及致突变、致癌和遗传毒性的倒千里光裂碱型吡咯里西啶生物碱，它是目前吡咯里西啶生物碱(pas)中研究最多的植物毒素之一。野百合碱主要存在于猪屎豆、响铃豆、臭灵丹草、番泻叶、苦玄参等植物中，被野百合碱污染的谷物、牛奶、蜜蜂等食物及含野百合碱的传统草药、补剂、茶等均可对人造成肝窦阻塞综合征、肝巨大细胞症、肌纤维化坏死等严重的肝脏损伤。含有野百合碱的中草药在临床多有使用，民间习用较为广泛，因服用含野百合碱的中草药或制品导致中毒的病理时有发生，目前在临床上尚未有效的预防和治疗药物，因此，其已引起各国食品药品监管机构的高度重视。

2、目前检测野百合碱常用的方法主要是仪器分析方法，包括：气相色谱-串联质谱法(gc-ms)、薄层色谱法(tlc)、高效液相色谱法(hplc)、高效液相色谱-质谱联用技术(hplc-ms法)等。仪器分析方法灵敏度好、精确度高，检测限低，假阳性率低，特异性强，但是样品前处理处理复杂，需要专业的人员，并且仪器设备昂贵、难以满足现场快速检测的要求。相对于仪器分析，免疫学检测方法前处理简单，具有便捷、快速、操作简单的诸多优点，并可提高检测灵敏度，降低检测成本，从而在大量样品初筛检测与现场快速检测上具有得天独厚的优势与极大的发展潜力。

3、免疫学检测法是一种利用抗原抗体特异性结合反应来检测各种物质的方法。目前针对野百合碱的高特异性单克隆抗体的制备很少。

技术实现思路

1、为解决上述技术问题，本发明提供了一株野百合碱单克隆抗体杂交瘤细胞株及其应用。本发明所得对野百合碱单克隆抗体野百合碱具有较好特异性和检测灵敏度，可以用于检测中草药及动物源性食品中野百合碱残留量。

2、本发明的第一个目的在于提供一株野百合碱单克隆抗体杂交瘤细胞株，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心cgmcc，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏日期2023年02月08日，保藏编号为cgmcc no.45471，分类命名：单克隆细胞株。

3、本发明的第二个目的在于提供一种野百合碱单克隆抗体杂交瘤细胞株的制备方法，包括以下步骤，

4、s1：将双稠吡咯啶-9-盐酸盐作为半抗原；

5、s2：将所述半抗原与载体蛋白偶联，得到完全抗原；

6、s3：将所述完全抗原与弗氏佐剂混合乳化，对小鼠进行皮下免疫，筛选免疫效果好的小鼠；

7、s4：将步骤s3筛选出的小鼠的脾细胞和骨髓瘤细胞进行融合，得到所述野百合碱单克隆抗体杂交瘤细胞株。

8、进一步的，所述步骤s1的半抗原结构如下：

9、

10、在本发明的任意实施例中，所述载体蛋白为牛血清白蛋白(bsa)或钥孔血蓝蛋白(klh)。

11、进一步的，所述步骤s2中，采用edc法将半抗原s1与载体蛋白偶联。

12、具体的，以bsa为例，完全抗原的制备：称取1mg haptens1(haptens1与牛血清白蛋白(bsa)摩尔比为40：1)，溶解于300μln,n-二甲基甲酰胺(dmf)中，先加2.8mg(n-羟基琥珀酰亚胺)nhs，室温反应10min后加入1.6mg edc(1-乙基-碳二亚胺盐酸盐)，室温下继续反应4h(称为a液)。取8mg bsa，用4ml 0.01m碳酸盐缓冲溶液(cb,ph＝9.0)溶解(称为b液)，再逐滴将a液缓慢加入到b液中，偶联过夜；然后用0.01m pbs溶液透析，除去未反应的小分子半抗原，得到完全抗原haptens1-bsa。

13、步骤s3中，首次免疫采用免疫原与完全弗氏佐剂混合乳化，多次加强免疫采用免疫原与不完全弗氏佐剂混合乳化，最后用生理盐水稀释免疫原后腹腔注射进行冲刺免疫。

14、具体的，首次免疫剂量为100μg/只；多次加强免疫剂量为50μg/只；首次免疫与第二次加强免疫之间间隔一个月，多次加强免疫之间间隔21天；冲刺免疫与最后一次加强免疫之间间隔18-21天。

15、所述步骤s4中，通过聚乙二醇(peg 4000)法将小鼠脾细胞和小鼠骨髓瘤细胞进行融合，采用选择性培养基(hat培养基)筛选出杂交瘤细胞，并用ht培养基进行细胞培养。融合一周后利用间接竞争酶联免疫法(ic-elisa)检测阳性细胞孔，并进一步利用ic-elisa法测定阳性细胞孔的抑制效果，通过有限稀释法对抑制较好的阳性细胞孔进行亚克隆，一周后再次检测、挑孔、亚克隆。按上述方法进行三次亚克隆后获得野百合碱的高分泌特异抗体的单克隆杂交瘤细胞株。

16、本发明的第三个目的在于提供一种野百合碱单克隆抗体，由所述的杂交瘤细胞株分泌得到。

17、本发明的第四个目的在于提供一种组合物，所述组合物中含有所述的杂交瘤细胞株或所述的野百合碱单克隆抗体。

18、本发明的第五个目的在于提供一种试剂盒，所述试剂盒中含有所述的杂交瘤细胞株、所述的野百合碱单克隆抗体或所述的组合物。

19、在本发明的任意实施例中还包括酶标板、野百合碱包被抗原、野百合碱标准液、酶标记二抗和底物反应液。

20、本发明的第六个目的在于提供一种胶体金试纸条，所述胶体金试纸条含有所述杂交瘤细胞株、所述的野百合碱单克隆抗体或所述组合物。

21、本发明的第七个目的在于提供一种芯片，所述芯片含有所述杂交瘤细胞株、所述的野百合碱单克隆抗体、所述组合物。

22、本发明的第八个目的在于提供所述的杂交瘤细胞株、所述的野百合碱单克隆抗体、所述的组合物、所述的试剂盒、所述的胶体金试纸条或所述的芯片在检测野百合碱中的应用。

23、本发明的上述技术方案相比现有技术具有以下优点：

24、本发明提供的细胞株分泌的单克隆抗体，对野百合碱具有较好的特异性、检测灵敏度(ic50值为500ng/ml)，可实现野百合碱的检测，特别是对中草药及动物源性食品中野百合碱残留量的检测，为食品中野百合碱残留的免疫检测提供了原料，具有实际应用价值。

25、生物材料样品保藏：一株野百合碱单克隆抗体杂交瘤细胞株，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心cgmcc，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏日期2023年02月08日，保藏编号为cgmcc no.45471。

技术特征：

1.一株野百合碱单克隆抗体杂交瘤细胞株，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心cgmcc，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏日期2023年02月08日，保藏编号为cgmccno.45471，分类命名：单克隆细胞株。

2.一种权利要求1所述的野百合碱单克隆抗体杂交瘤细胞株的制备方法，其特征在于，包括以下步骤，

3.根据权利要求2中所述的制备方法，其特征在于，所述载体蛋白为牛血清白蛋白或钥孔血蓝蛋白；

4.一种野百合碱单克隆抗体，其特征在于，由权利要求1中所述的杂交瘤细胞株分泌得到。

5.一种组合物，其特征在于，所述组合物中含有权利要求1所述的杂交瘤细胞株或权利要求4所述的野百合碱单克隆抗体。

6.一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中含有权利要求1所述的杂交瘤细胞株、权利要求4所述的野百合碱单克隆抗体或权利要求5所述的组合物。

7.根据权利要求6中所述试剂盒，其特征在于，还包括酶标板、野百合碱包被抗原、野百合碱标准液、酶标记二抗和底物反应液。

8.一种胶体金试纸条，其特征在于，所述胶体金试纸条含有权利要求1中所述杂交瘤细胞株、权利要求4中所述的野百合碱单克隆抗体或权利要求4中所述组合物。

9.一种芯片，其特征在于，所述芯片含有权利要求1中所述杂交瘤细胞株、权利要求3中所述的野百合碱单克隆抗体、权利要求4中所述组合物。

10.权利要求1所述的杂交瘤细胞株、权利要求4所述的野百合碱单克隆抗体、权利要求5所述的组合物、权利要求6或7所述的试剂盒、权利要求8所述的胶体金试纸条或权利要求9所述的芯片在检测野百合碱中的应用。

技术总结
本发明属于免疫化学技术领域，具体涉及一株野百合碱单克隆抗体杂交瘤细胞株及其应用。该杂交瘤细胞株，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏日期2023年02月08日，保藏编号为CGMCCNo.45471。本发明提供的细胞株分泌的单克隆抗体，对野百合碱具有较好的特异性和检测灵敏度(IC<subgt;50</subgt;值为0.37μg/mL)，可实现野百合碱的检测，特别是对中草药及动物源性食品中野百合碱残留量的检测，为中草药及动物源性食品中野百合碱残留的免疫检测提供了原料，具有实际应用价值。

技术研发人员：孙茂忠,李小芳,胥传来,匡华,徐丽广,吴晓玲,刘丽强,郝昌龙,宋珊珊,吴爱红,郭玲玲,胥欣欣
受保护的技术使用者：江南大学
技术研发日：
技术公布日：2024/3/27