1型禽腺病毒疫苗、蛋黄抗体的制备方法
【专利摘要】本发明公开了一种1型禽腺病毒疫苗、蛋黄抗体的制备方法，属于兽用生物制品领域。本发明的1型禽腺病毒疫苗的制备方法包括1型禽腺病毒接种鸡胚肝细胞制备抗原、测定抗原的病毒含量、含量合格的抗原经灭活剂灭活、灭活检验合格的抗原与佐剂混合乳化制备疫苗等步骤。本发明的1型禽腺病毒蛋黄抗体的制备方法包括疫苗免疫产蛋鸡、收集高免蛋、提取抗体、测定效价等步骤。本发明制备的1型禽腺病毒疫苗具有抗原含量高、质量稳定等优点；本发明制备的1型禽腺病毒蛋黄抗体对1型禽腺病毒有很好的预防和治疗效果。
【专利说明】
1型禽腺病毒疫苗、蛋黄抗体的制备方法
技术领域
[0001] 本发明涉及兽用生物制品领域，具体涉及1型禽腺病毒疫苗、蛋黄抗体的制备方 法。
【背景技术】
[0002] 全病毒灭活疫苗是一种常用的预防畜禽传染病的兽用生物制品。生物组织繁殖病 毒，获得的病毒经甲醛等灭活剂作用，使病毒失去复制、繁殖的能力，但保留免疫原性，此种 灭活后的全病毒可作为抗原与佐剂混合乳化制备灭活疫苗。制备的灭活疫苗经性状检验、 安全检验、效力检验等，符合质量标准的疫苗可上市使用。
[0003] 兽用生物制品中常用的治疗性抗体多为蛋黄抗体。蛋黄抗体是将抗原制成疫苗免 疫产蛋鸡，采集针对该病具有中和能力的蛋黄，经过适当处理，接种易感动物，用于预防或 治疗该病。所述蛋黄抗体有的经过简单的稀释、灭活后使用;有的经过了精制提纯、浓缩提 高效价、冷冻干燥等深加工。商品化的蛋黄抗体是经过农业部批准的、具有生产文号的、经 过深加工的、有质量保障的有效广品。
【发明内容】
[0004] 本发明的首要目的在于提供一种1型禽腺病毒疫苗的制备方法;本发明的另一目 的在于提供一种检验1型禽腺病毒疫苗效力的方法;本发明的再一目的在于提供一种1型禽 腺病毒蛋黄抗体的制备方法。
[0005] 本发明的目的通过以下技术方案实现：
[0006] -种1型禽腺病毒疫苗的制备方法，包括如下步骤：
[0007] (1)将1型禽腺病毒接种鸡胚肝细胞进行培养，待50 % -70 %细胞出现细胞病变时 收获细胞，即得到1型禽腺病毒抗原。
[0008] (2)测定1型禽腺病毒抗原的病毒含量，含量不低于107'5TCID 5Q/0.1mL的抗原用于 后续制备疫苗。
[0009] (3)1型禽腺病毒抗原经甲醛或二乙烯亚胺灭活后接种鸡胚肝细胞，并盲传若干 代，对1型禽腺病毒抗原进行灭活检验判定是否灭活完全。
[0010] (4)灭活完全的1型禽腺病毒抗原与矿物油佐剂混合，乳化制备疫苗;通过血清学 方法或攻毒法检验疫苗效力，检验合格的疫苗即为1型禽腺病毒疫苗。
[0011] 所述的血清学方法包括如下步骤:取3~4周龄SPF鸡10-20只各颈部皮下注射疫苗 〇.3mL，另用5-10只鸡不接种作为对照;接种后第21日，免疫鸡连同对照鸡，分别采血、分离 血清，用微量中和试验法测定血清中和抗体效价;免疫鸡血清中和抗体效价几何平均值不 低于1:000-1:10000,对照鸡血清中和抗体效价不高于1:100,则检验合格。其中微量中和试 验法包括如下步骤：
[0012] 1)用细胞生长液(含6 % -10 %新生牛血清的DMEM培养液)悬浮鸡胚肝细胞接种96 孔细胞培养板，用于接种的细胞量为30000-100000个肝细胞/0.1 mL/孔，37 °C、5 % 0)2培养 箱培养24小时，备用。
[0013 ] 2)将被检样品用细胞维持液(含2 % -4 %新生牛血清的DMEM培养液)做IO倍系列稀 释。
[0014] 3)1型禽腺病毒用细胞维持液稀释至100-1000TCID5Q/0. lmL。
[0015] 4)向步骤2)不同稀释度的样品中加入等体积100-1000TCID5Q/0.1mL的1型禽腺病 毒，混匀，37°C孵育1小时。
[0016] 5)弃去96孔细胞培养板中的细胞生长液，用步骤(4)孵育得到的各混合液接种96 孔细胞培养板，〇. 2mL/孔，每个稀释度6-8孔。
[0017] 6)接种后第7日，显微镜下观察96孔细胞培养板，统计各稀释度出现、不出现CPE孔 的数量，以Reed-Muench法计算被检样品中和效价。
[0018] 所述的攻毒法包括如下步骤：取3~4周龄SPF鸡10-20只各颈部皮下注射疫苗 〇.3mL，另用5-10只鸡不接种作为对照;接种后第21日，免疫鸡连同对照鸡各肌肉注射或滴 鼻点眼接种浓度为l〇〇-l〇〇〇〇〇〇〇〇TCID 5Q/0.1mL的1型禽腺病毒液O.lmL;接种病毒后第5日 以棉拭子沾取泄殖腔内容物作为被检样品，采集的棉拭子放入装有0.5-1.OmL含1000单位/ mL青霉素和1000单位/mL庆大霉素的细胞维持液的容器中，进行病毒分尚，对照鸡病毒分尚 为80%-100%阳性，免疫鸡病毒分离为80%-100%阴性；或接种病毒后10日内，对照鸡 40 % -100 %死亡，免疫鸡90 % -100 %健活，则检验合格。其中病毒分离的方法法包括如下步 骤：
[0019] 1)用细胞生长液悬浮鸡胚肝细胞接种6孔细胞培养板，用于接种的细胞量为 1000000-6000000个肝细胞/2mL/孔，37°C、5%CO 2培养箱培养24小时，备用。
[0020] 2)棉拭子在细胞维持液中多次与容器壁挤压，使病毒粒子释放到细胞维持液中， 弃去棉拭子，含有病毒粒子的细胞维持液作为被检样品备用。
[0021 ] 3)弃去6孔细胞培养板中的细胞生长液，加入2-3mL细胞维持液，将0.3mL-0.5mL被 检样品加入6孔板的其中一孔，37 °C、5 % CO2培养箱培养。
[0022] 4)接种后第7日，显微镜下观察6孔细胞培养板，统计各孔出现、不出现CPE的情况； 用间接免疫荧光法检测6孔板中出现的CPE是否是由1型禽腺病毒感染引起的特异性CPE;出 现特异性CPE的孔所对应的被检样品病毒分离为阳性，不出现CPE的孔所对应的被检样品病 毒分尚为阴性。
[0023] 所述的1型禽腺病毒疫苗的制备方法的步骤（1)优选为：以14-17日龄鸡胚的肝脏 为材料，用胰酶消化使鸡胚肝细胞分散，分散的鸡胚肝细胞悬浮于细胞生长液中，转入细胞 培养瓶中37 °C培养;待鸡胚肝细胞贴壁并生长至70 % -100 %铺满底壁时弃去细胞生长液， 加入细胞维持液，接种1型禽腺病毒，37 °C培养2-4天，待50 % -70 %细胞出现细胞病变时，收 集细胞维持液，即得到1型禽腺病毒抗原。
[0024] 步骤(2)中所述的病毒含量测定的方法优选包括如下步骤：
[0025] 1)用细胞生长液悬浮鸡胚肝细胞接种96孔细胞培养板，用于接种的细胞量为 30000-100000个肝细胞/0.1 mL/孔，37°C、5%CO2培养箱培养24小时，备用。
[0026] 2)将被检样品用细胞维持液做10倍系列稀释。
[0027] 3)将96孔细胞培养板内的细胞生长液弃去，I(T6、1 〇Λ I(T8、I(T9稀释的被检样品接 种96孔细胞培养板，0.1 mL/孔，每个稀释度6-8个重复孔，置于37 °C、5 % CO2培养箱培养。
[0028] 4)接种后第7日，显微镜下观察96孔细胞培养板，统计各稀释度出现、不出现CPE孔 的数量，以Reed-Muench法计算被检样品TCID5q含量。
[0029]步骤（3)中所述的灭活的方法优选包括如下步骤：向抗原中加入终浓度0.05%_ 0.2 % (v/v)的甲醛或终浓度5mM的二乙烯亚胺，37°C灭活16-32小时，加入终浓度5mM的硫代 硫酸钠终止灭活。
[0030] 步骤(3)中所述的灭活检验的方法优选包括如下步骤步骤(3)中所述的灭活检验 的方法包括如下步骤:取〇.2-2mL灭活后的抗原接种培养了 16-24小时的鸡胚肝细胞，作为 Fl代;Fl代培养72小时如无细胞病变再接种培养了 16-24小时的鸡胚肝细胞，作为F2代;F2 代培养168小时如无细胞病变说明为被检抗原灭活完全。
[0031] -种1型禽腺病毒疫苗，通过上述方法制备得到。
[0032] -种检验1型禽腺病毒疫苗效力的方法，为血清学方法或攻毒法。
[0033]所述的血清学方法包括如下步骤:取3~4周龄SPF鸡10-20只各颈部皮下注射疫苗 〇.3mL，另用5-10只鸡不接种作为对照;接种后第21日，免疫鸡连同对照鸡，分别采血、分离 血清，用微量中和试验法测定血清中和抗体效价;免疫鸡血清中和抗体效价几何平均值不 低于1:000-1:10000,对照鸡血清中和抗体效价不高于1:100,则检验合格。其中微量中和试 验法包括如下步骤：
[0034] 1)用细胞生长液悬浮鸡胚肝细胞接种96孔细胞培养板，用于接种的细胞量为 30000-100000个肝细胞/0.1 mL/孔，37°C、5%CO2培养箱培养24小时，备用。
[0035] 2)将被检样品用细胞维持液做10倍系列稀释。
[0036] 3)1型禽腺病毒以细胞维持液稀释至100-1000TCID5Q/0. lmL。
[0037] 4)向步骤2)不同稀释度的样品中加入等体积100-1000TCID5Q/0.1mL的1型禽腺病 毒，混匀，37°C孵育1小时。
[0038] 5)弃去96孔细胞培养板中的细胞生长液，用步骤(4)孵育得到的各混合液接种96 孔细胞培养板，〇. 2mL/孔，每个稀释度6-8孔。
[0039] 6)接种后第7日，显微镜下观察96孔细胞培养板，统计各稀释度出现、不出现CPE孔 的数量以Reed-Muench法计算被检样品中和效价。
[0040] 所述的攻毒法包括如下步骤：取3~4周龄SPF鸡10-20只各颈部皮下注射疫苗 〇.3mL，另用5-10只鸡不接种作为对照;接种后第21日，免疫鸡连同对照鸡各肌肉注射或滴 鼻点眼接种浓度为l〇〇-l〇〇〇〇〇〇〇〇TCID 5Q/0.1mL的1型禽腺病毒液O.lmL;接种病毒后第5日 以棉拭子沾取泄殖腔内容物作为被检样品，采集的棉拭子放入装有0.5-1.OmL含1000单位/ mL青霉素和1000单位/mL庆大霉素的细胞维持液的容器中，进行病毒分尚，对照鸡病毒分尚 为80%-100%阳性，免疫鸡病毒分离为80%-100%阴性；或接种病毒后10日内，对照鸡 40 % -100 %死亡，免疫鸡90 % -100 %健活，则检验合格。其中病毒分离的方法法包括如下步 骤：
[0041] 1)用细胞生长液悬浮鸡胚肝细胞接种6孔细胞培养板，用于接种的细胞量为 1000000-6000000个肝细胞/2mL/孔，37°C、5%CO 2培养箱培养24小时，备用。
[0042] 2)棉拭子在细胞维持液中多次与容器壁挤压，使病毒粒子释放到细胞维持液中， 弃去棉拭子，含有病毒粒子的细胞维持液作为被检样品备用。
[0043] 3)弃去6孔细胞培养板中的细胞生长液，加入2-3mL细胞维持液，将0.3mL-0.5mL被 检样品加入6孔板的其中一孔，37 °C、5 % CO2培养箱培养。
[0044] 4)接种后第7日，显微镜下观察6孔细胞培养板，统计各孔出现、不出现CPE的情况； 用间接免疫荧光法检测6孔板中出现的CPE是否是由1型禽腺病毒感染引起的特异性CPE;出 现特异性CPE的孔所对应的被检样品病毒分离为阳性，不出现CPE的孔所对应的被检样品病 毒分尚为阴性。
[0045] -种1型禽腺病毒蛋黄抗体的制备方法，包括如下步骤：
[0046] (1)将通过上述方法制备得到的1型禽腺病毒疫苗多次免疫产蛋鸡，用微量中和试 验法（同上述血清学方法中的微量中和试验法）测定蛋黄抗体效价，效价达到1:1000-1: 10000以上时，收集鸡蛋；
[0047] (2)分离蛋黄，提取蛋黄抗体，使用甲醛或二乙烯亚胺灭活蛋黄抗体；
[0048] (3)用微量中和试验法测定蛋黄抗体效价，并将蛋黄抗体用PBS或生理盐水稀释使 其效价达到预防或治疗剂量，得到1型禽腺病毒蛋黄抗体。
[0049] -种1型禽腺病毒蛋黄抗体，通过上述方法制备得到。
[0050] 与已有技术相比，本发明有益效果：
[0051] 1型禽腺病毒能在鸡胚、鸡胚肝细胞、鸡胚肾细胞中繁殖，但经过系统比较，我们发 现以鸡胚肝细胞制备抗原的效价高于其他生物材料制备的抗原，本方案选用鸡胚肝细胞制 备抗原，进而制备的疫苗性能更优;疫苗免疫鸡所产蛋的蛋黄抗体效价高;单独使用疫苗同 样具有较好的免疫保护效果。
[0052]有关攻毒法效力检验:攻毒法效力检验是评判某种疫苗效力的黄金标准、常用标 准，即根据对照鸡死亡比例、免疫鸡健活比例，评估疫苗的保护效果。本发明所提供的技术 方案，在此基础上加入对照鸡排毒率、免疫鸡排毒率的指标，能进一步准确评估疫苗的保护 效果。本发明还提供了灵敏、准确的排毒检测的技术方案。
[0053]本发明所提供的排毒检测的技术方案：棉拭子沾取泄殖腔内容物，挤压棉拭子使 泄殖腔内容物可能含有的目的病毒分散到细胞维持液中，培养于6孔细胞培养板中的鸡胚 肝细胞检测样品中是否存在病毒，从而判定实验鸡是否排毒。此方案的灵敏性、准确性体现 在：1)使用方案中的棉拭子处理方法，使得加入6孔细胞培养板中的样品不负面影响细胞生 长状态，可以接入较大剂量，能够最大限度、最为准确的检测样品中是否含有病毒，即检测 机体是否排毒;2)通过反复研究我们发现鸡胚肝细胞法是最为灵敏的检测1型禽腺病毒的 方法;3)PCR、胶体金免疫层析法方法等检测出阳性结果，仅说明被检样品含有病毒粒子，但 无法确定是否是活病毒（只有检测出活病毒才能说明机体排毒），本方案检测的是活病毒， 检测出阳性结果能够说明机体排毒;4)间接免疫荧光定性检测鸡胚肝细胞感染的是否是1 型禽腺病毒，避免鸡胚肝细胞感染其他病毒造成的误判。
[0054]有关血清学方法效力检验:减少攻毒实验的数量是生物安全防范的基本原则、也 是降低生物安全风险的有效手段。1型禽腺病毒是体液免疫为主的疫病，通过研究我们发现 实验鸡血清中和抗体效价与攻毒保护有良好的平行关系。通过检测实验鸡血清中和抗体效 价能够评估疫苗的保护效果，是可以替代攻毒法的效力检验方法。
[0055]禽用疫苗抗原效价的标定、禽用疫苗灭活抗原的灭活检验、蛋黄(或血清）的中和 抗体效价，多使用鸡胚为生物载体进行标定。1型禽腺病毒能引起鸡胚感染，但感染胚的病 变不明显，难以与健康胚区分。所以用鸡胚法标定抗原效价、做灭活检验、测定蛋黄(或血 清）的中和抗体效价，存在技术问题，或无法实现或结果不准确。经研究，1型禽腺病毒能感 染鸡胚肝细胞并产生CPE，通过优化实验参数，确定了使用鸡胚肝细胞为生物载体的疫苗抗 原效价的标定方法、抗原的灭活检验方法、蛋黄(或血清)的中和抗体效价测定方法。
[0056] 本发明制备的1型禽腺病毒疫苗具有抗原含量高、质量稳定等优点;本发明制备的 1型禽腺病毒蛋黄抗体对1型禽腺病毒有很好的预防和治疗效果。
【附图说明】
[0057] 图1是显微镜下观察的未被血清中和的病毒感染鸡胚肝细胞产生的细胞病变形态 图。
[0058]图2是显微镜下观察的被血清完全中和的病毒无法感染鸡胚肝细胞的形态图。
【具体实施方式】
[0059] 下面结合实施例及附图对本发明作进一步说明。应当理解的是，这些实施例仅仅 是用于进一步解释和说明本发明，其不应被理解为是对本发明保护范围的限制。若未特别 指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
[0060] 下述实施例中用到细胞生长液为含6 % -10 %新生牛血清的DMEM培养液，细胞维持 液为含2 % _4 %新生牛血清的DMEM培养液。
[0061] 实施例1 1型禽腺病毒疫苗的制备
[0062] (1)制备鸡胚肝细胞
[0063]取20枚15日龄鸡胚，采集肝脏，剪刀剪碎，使组织块为2mm左右，PBS洗去组织块表 面血水。向组织中加入0.25 %胰酶80mL，37 °C孵育1小时，弃去胰酶。向组织中加入80mL细胞 生长液，吸管吹打组织，使细胞分散。8层纱布过滤细胞液，向细胞液中补加细胞生长液使体 积为120mL。细胞液平均分装于3个Tl 82细胞培养瓶。37 °C培养24小时。
[0064] (2)制备抗原
[0065]弃去T182细胞培养瓶中的细胞生长液，每瓶加入细胞维持液40mL，加入1型禽腺病 毒0.1 mL(含IO7TCID5q的1型禽腺病毒），37°C培养72小时，70%的细胞出现细胞病变，收获细 胞液即为目的抗原。
[0066] (3)测定抗原的病毒含量(TCID5q含量）
[0067] 用细胞生长液悬浮鸡胚肝细胞接种96孔细胞培养板，接种量IX IO5个细胞/ 0.1 mL/孔，37°C、5%C02培养箱培养24小时，备用。将被检抗原用细胞维持液做10倍系列稀 释。10'1〇Λ 10'HT9稀释的被检样品接种96孔细胞培养板，0.1 mL/孔，每个稀释度6-8个 重复孔，置于37°C、5%⑶2培养箱培养。接种后第7日，显微镜下观察96孔细胞培养板，统计 各稀释度出现、不出现CPE孔的数量，以Reed-Muench法计算被检抗原病毒含量为 10 8.°TCID5〇/0.1mL。
[0068] (4)灭活抗原
[0069] 向120mL抗原中加入终浓度5mM的二乙烯亚胺(BEI)，37°C孵育24小时，加入终浓度 5mM的硫代硫酸钠终止灭活。
[0070] (5)灭活检验
[0071 ]如（1)方法制备鸡胚肝细胞，6mL细胞液装于T25细胞培养瓶中，培养24小时左右， 弃去细胞生长液，加入6mL细胞维持液，取0.2mL灭活后的抗原接种T25细胞培养瓶，作为Fl 代;Fl代37°C培养72小时未见细胞病变，取ImL细胞培养瓶中的细胞维持液接种另一瓶T25 细胞培养瓶中培养至24小时左右的鸡胚肝细胞，作为F2代;F2代37°C培养168小时未见细胞 病变。说明为被检抗原被灭活完全。
[0072] (6)乳化制苗
[0073] 灭活的抗原中加入吐温80使吐温80占总体积的4%，混匀即为水相；白油中加入司 本80和硬脂酸铝，使司本80占总体积的6%、硬脂酸铝与白油的质量体积比为1.5%，混合加 热溶解，灭菌后即为油相。水相:油相(体积比）=1:2的比例以剪切机高速剪切，使成为油乳 剂疫苗。如此得到获得含32 %抗原(灭活病毒液)的疫苗。
[0074]实施例2血清学方法检验疫苗效力
[0075] 1)取3~4周龄SPF鸡10只各颈部皮下注射实施例1制备的疫苗0.3mL，另用10只鸡 不接种作为对照;接种后第21日，免疫鸡连同对照鸡，分别采血、分离血清，备用。
[0076] 2)用细胞生长液悬浮鸡胚肝细胞接种96孔细胞培养板，用于接种的细胞量为IO5 个肝细胞/〇. ImL/孔，37°C、5%CO2培养箱培养24小时，备用。
[0077] 3)将被检血清样品用细胞维持液做10倍系列稀释，获得1〇Λ 10'10'10'10 一6 稀释的被检血清备用。
[0078] 4)1型禽腺病毒用细胞维持液稀释至1000TCID5Q/0. lmL。
[0079] 5)向步骤2)稀释的样品中加入等体积1000TCID5Q/0.1 mL的1型禽腺病毒，混匀，37 °C孵育1小时。
[0080] 6)弃去96孔细胞培养板中的细胞生长液，用步骤(4)孵育得到的各混合液接种96 孔细胞培养板，〇. 2mL/孔，每个稀释度6-8孔。
[0081] 7)接种后第7日，显微镜下观察96孔细胞培养板，未被血清中和的病毒感染鸡胚肝 细胞产生细胞病变(图1);被血清完全中和的病毒无法感染鸡胚肝细胞（图2)，无细胞病变。 统计各稀释度出现、不出现CPE孔的数量，以Reed-Muench法计算被检样品中和效价。
[0082] 8)经计算免疫鸡血清中和抗体分别为25119、25119、3981、10000、31623、10000、 31623、3162、25119、3981，效价几何平均值为16973，对照鸡血清中和抗体效价均不高于1: 31。疫苗效力通过血清学方法检验合格。
[0083]实施例3攻毒法检验疫苗效力
[0084] 1)取3~4周龄SPF鸡10只各颈部皮下注射实施例1制备的疫苗0.3mL，另用10只鸡 不接种作为对照；接种后第21日，免疫鸡连同对照鸡各肌肉注射或滴鼻点眼接种浓度为 100TCID5Q/0.1 mL的1型禽腺病毒液0.1 mL;接种病毒后第5日以棉拭子沾取泄殖腔内容物作 为被检样品，采集的棉拭子放入装有ImL含1000单位/mL青霉素和1000单位/mL庆大霉素的 细胞维持液的容器中。棉拭子在细胞维持液中多次与容器壁挤压，使病毒粒子释放到细胞 维持液中，弃去棉拭子，含有病毒粒子的细胞维持液作为被检样品备用。
[0085] 2)用细胞生长液悬浮鸡胚肝细胞接种6孔细胞培养板，用于接种的细胞量为3 X IO6个肝细胞/2mL/孔，37°C、5 %CO2培养箱培养24小时，备用。
[0086] 3)弃去6孔细胞培养板中的细胞生长液，加入2mL细胞维持液，将0.5mL被检样品加 入6孔板的其中一孔，37 °C、5 % CO2培养箱培养。
[0087] 4)接种后第7日，显微镜下观察6孔细胞培养板，统计各孔出现、不出现CPE的情况。 用常规间接免疫荧光法检测6孔板中出现的CPE是否是由1型禽腺病毒感染引起的特异性 CPE;出现特异性CPE的孔所对应的被检样品病毒分离为阳性，不出现CPE的孔所对应的被检 样品病毒分离为阴性。
[0088] 5)对照鸡病毒分呙为9/10阳性，免疫鸡病毒分呙为9/10阴性;接种病毒后10日内， 对照鸡4/10死亡，免疫鸡10/10健活。疫苗效力通过攻毒法检验合格。
[0089] 实施例4 1型禽腺病毒蛋黄抗体的制备
[0090] 将实施例1制备的1型禽腺病毒疫苗免疫产蛋鸡100只，颈部皮下注射，ImL/只；间 隔2周进行第二次免疫，颈部皮下注射，ImL/只；间隔2周进行第三次免疫，颈部皮下注射， ImL/只。再间隔2周取当日所产10枚鸡蛋，分离蛋黄、混合蛋黄、取样，用微量中和试验法测 定样品抗体效价为1:10000。
[0091 ]收取随后1周所产鸡蛋560枚;蛋黄分离器分离蛋黄，将蛋黄搅拌成均匀膏状，加入 与蛋黄等体积的注射用水，65°C保温30分钟，再加入原蛋黄体积4倍的注射用水，搅拌均匀； 用lmol/L盐酸调pH值至5.4,4°C静置12小时;6000r/min离心15分钟，取上清；向上清液中加 入终浓度0.2 % (v/v)的辛酸，搅拌均匀，4°C放置6小时，滤布过滤去除渣滓，加终浓度0.1 % 的甲醛(v/v)37°C灭活16小时得到蛋黄抗体。以微量中和试验法测定蛋黄抗体效价为1: 10000ο
[0092]实施例5蛋黄抗体的应用
[0093] (1)6周龄SPF鸡60只，分6组，每组10只，饲养于不同隔离器中（见表1)。其中第5组 腿部肌肉接种实施例4制备的蛋黄抗体lmL，6小时后1组、3组、5组腿部肌肉接种1型禽腺病 毒 lOOOTCIDso/O.lmL/只。
[0094] (2)接种后3日，部分病毒接种鸡发病，表现为米食量降低、被毛逆立。此时，1号隔 离器中的20只鸡各接种实施例4制备的蛋黄抗体ImL。
[0095] (3)各组再观察21天，各组鸡发病、死亡情况见表1。
[0096]表1发病、死亡情况统计表
[0098] (5)各组发病、死亡情况分析
[0099] 比较分析1组、3组数据，说明蛋黄抗体对发病鸡或感染鸡有治疗效果；比较分析2 组、4组数据，说明蛋黄抗体对同居感染鸡有预防、治疗效果;比较分析3组、5组数据，说明蛋 黄抗体对该病有预防效果。
[0100] 上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的 限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化， 均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
【主权项】
1. 一种1型禽腺病毒疫苗的制备方法，其特征在于包括如下步骤： (1) 将1型禽腺病毒接种鸡胚肝细胞进行培养，待50%-70%细胞出现细胞病变时收获细 胞，即得到1型禽腺病毒抗原； (2) 测定1型禽腺病毒抗原的病毒含量，含量不低于107'5TCID5Q/0.1mL的抗原用于后续 制备疫苗； (3) 1型禽腺病毒抗原经甲醛或二乙烯亚胺灭活后接种鸡胚肝细胞，并盲传若干代，对1 型禽腺病毒抗原进行灭活检验判定是否灭活完全； (4) 灭活完全的1型禽腺病毒抗原与矿物油佐剂混合，乳化制备疫苗;通过血清学方法 或攻毒法检验疫苗效力，检验合格的疫苗即为1型禽腺病毒疫苗； 所述的血清学方法包括如下步骤：取3~4周龄SPF鸡10-20只各颈部皮下注射疫苗 〇.3mL，另用5-10只鸡不接种作为对照;接种后第21日，免疫鸡连同对照鸡，分别采血、分离 血清，用微量中和试验法测定血清中和抗体效价;免疫鸡血清中和抗体效价几何平均值不 低于1:000-1:10000，对照鸡血清中和抗体效价不高于1:100，则检验合格;其中微量中和试 验法包括如下步骤： 1) 用细胞生长液悬浮鸡胚肝细胞接种96孔细胞培养板，用于接种的细胞量为30000-100000个肝细胞/0. lmL/孔，37°C、5% C02培养箱培养24小时，备用； 2) 将被检样品用细胞维持液做10倍系列稀释； 3) 1型禽腺病毒用细胞维持液稀释至100-1000TCID5Q/0.1mL; 4) 向步骤2)不同稀释度的样品中加入等体积100-1000TCID5Q/0. lmL的1型禽腺病毒，混 匀，37 °C孵育1小时； 5) 弃去96孔细胞培养板中的细胞生长液，用步骤(4)孵育得到的各混合液接种96孔细 胞培养板，〇. 2mL/孔，每个稀释度6-8孔； 6) 接种后第7日，显微镜下观察96孔细胞培养板，统计各稀释度出现、不出现CPE孔的数 量，以Reed-Muench法计算被检样品中和效价； 所述的攻毒法包括如下步骤:取3~4周龄SPF鸡10-20只各颈部皮下注射疫苗0.3mL，另 用5-10只鸡不接种作为对照;接种后第21日，免疫鸡连同对照鸡各肌肉注射或滴鼻点眼接 种浓度为l〇〇-l〇〇〇〇〇〇〇〇TCID 5Q/0.1mL的1型禽腺病毒液O.lmL;接种病毒后第5日以棉拭子 沾取泄殖腔内容物作为被检样品，采集的棉拭子放入装有0.5-1.OmL含1000单位/mL青霉素 和1000单位/mL庆大霉素的细胞维持液的容器中，进行病毒分尚，对照鸡病毒分尚为80%-100%阳性，免疫鸡病毒分离为80%-100%阴性;或接种病毒后10日内，对照鸡40%-100%死亡， 免疫鸡90%-100%健活，则检验合格;其中病毒分离的方法包括如下步骤： 1) 用细胞生长液悬浮鸡胚肝细胞接种6孔细胞培养板，用于接种的细胞量为1000000-6000000个肝细胞/2mL/孔，37°C、5% C02培养箱培养24小时，备用； 2) 棉拭子在细胞维持液中多次与容器壁挤压，使病毒粒子释放到细胞维持液中，弃去 棉拭子，含有病毒粒子的细胞维持液作为被检样品备用； 3) 弃去6孔细胞培养板中的细胞生长液，加入2-3mL细胞维持液，将0.3mL-0.5mL被检样 品加入6孔板的其中一孔，37°C、5% C02培养箱培养； 4) 接种后第7日，显微镜下观察6孔细胞培养板，统计各孔出现、不出现CPE的情况;用间 接免疫荧光法检测6孔板中出现的CPE是否是由1型禽腺病毒感染引起的特异性CPE;出现特 异性CPE的孔所对应的被检样品病毒分离为阳性，不出现CPE的孔所对应的被检样品病毒分 离为阴性。2. 根据权利要求1所述的1型禽腺病毒疫苗的制备方法，其特征在于:步骤（1)为：以14-17日龄鸡胚的肝脏为材料，用胰酶消化使鸡胚肝细胞分散，分散的鸡胚肝细胞悬浮于细胞 生长液中，转入细胞培养瓶中37°C培养;待鸡胚肝细胞贴壁并生长至70%-100%铺满底壁时 弃去细胞生长液，加入细胞维持液，接种1型禽腺病毒，37 °C培养2-4天，待50%-70%细胞出现 细胞病变时，收集细胞维持液，即得到1型禽腺病毒抗原。3. 根据权利要求1所述的1型禽腺病毒疫苗的制备方法，其特征在于:步骤(2)中所述的 病毒含量测定的方法包括如下步骤： 1) 用细胞生长液悬浮鸡胚肝细胞接种96孔细胞培养板，用于接种的细胞量为30000-100000个肝细胞/0. lmL/孔，37°C、5% C02培养箱培养24小时，备用； 2) 将被检样品用细胞维持液做10倍系列稀释； 3) 将96孔细胞培养板内的细胞生长液弃去，10-6、10-7、10-8、ΚΓ 9稀释的被检样品接种96 孔细胞培养板，〇. lmL/孔，每个稀释度6-8个重复孔，置于37 °C、5% C02培养箱培养； 4) 接种后第7日，显微镜下观察96孔细胞培养板，统计各稀释度出现、不出现CPE孔的数 量，以Reed-Muench法计算被检样品TCID 5Q含量。4. 根据权利要求1所述的1型禽腺病毒疫苗的制备方法，其特征在于:步骤(3)中所述的 灭活的方法包括如下步骤：向抗原中加入终浓度〇 . 〇5%-〇 . 2%的甲醛或终浓度5mM的二乙烯 亚胺，37°C灭活16-32小时，加入终浓度5mM的硫代硫酸钠终止灭活。5. 根据权利要求1所述的1型禽腺病毒疫苗的制备方法，其特征在于:步骤(3)中所述的 灭活检验的方法包括如下步骤:取0.2-2mL灭活后的抗原接种培养了 16-24小时的鸡胚肝细 胞，作为F1代;F1代培养72小时如无细胞病变再接种培养了 16-24小时的鸡胚肝细胞，作为 F2代;F2代培养168小时如无细胞病变说明为被检抗原灭活完全。6. -种1型禽腺病毒疫苗，其特征在于:通过权利要求1-5任一项所述的方法制备得到。7. -种检验1型禽腺病毒疫苗效力的方法，其特征在于:为血清学方法或攻毒法； 所述的血清学方法包括如下步骤：取3~4周龄SPF鸡10-20只各颈部皮下注射疫苗 〇.3mL，另用5-10只鸡不接种作为对照;接种后第21日，免疫鸡连同对照鸡，分别采血、分离 血清，用微量中和试验法测定血清中和抗体效价;免疫鸡血清中和抗体效价几何平均值不 低于1:000-1:10000，对照鸡血清中和抗体效价不高于1:100，则检验合格;其中微量中和试 验法包括如下步骤： 1) 用细胞生长液悬浮鸡胚肝细胞接种96孔细胞培养板，用于接种的细胞量为30000-100000个肝细胞/0. lmL/孔，37°C、5% C02培养箱培养24小时，备用； 2) 将被检样品用细胞维持液做10倍系列稀释； 3) 1型禽腺病毒以细胞维持液稀释至100-1000TCID5Q/0.1mL; 4) 向步骤2)不同稀释度的样品中加入等体积100-1000TCID5Q/0. lmL的1型禽腺病毒，混 匀，37 °C孵育1小时； 5) 弃去96孔细胞培养板中的细胞生长液，用步骤(4)孵育得到的各混合液接种96孔细 胞培养板，〇. 2mL/孔，每个稀释度6-8孔； 6) 接种后第7日，显微镜下观察96孔细胞培养板，统计各稀释度出现、不出现CPE孔的数 量，以Reed-Muench法计算被检样品中和效价； 所述的攻毒法包括如下步骤:取3~4周龄SPF鸡10-20只各颈部皮下注射疫苗0.3mL，另 用5-10只鸡不接种作为对照;接种后第21日，免疫鸡连同对照鸡各肌肉注射或滴鼻点眼接 种浓度为l〇〇-l〇〇〇〇〇〇〇〇TCID 5Q/0.1mL的1型禽腺病毒液O.lmL;接种病毒后第5日以棉拭子 沾取泄殖腔内容物作为被检样品，采集的棉拭子放入装有0.5-1.OmL含1000单位/mL青霉素 和1000单位/mL庆大霉素的细胞维持液的容器中，进行病毒分尚，对照鸡病毒分尚为80%-100%阳性，免疫鸡病毒分离为80%-100%阴性;或接种病毒后10日内，对照鸡40%-100%死亡， 免疫鸡90%-100%健活，则检验合格;其中病毒分离的方法包括如下步骤： 1) 用细胞生长液悬浮鸡胚肝细胞接种6孔细胞培养板，用于接种的细胞量为1000000-6000000个肝细胞/2mL/孔，37°C、5% C02培养箱培养24小时，备用； 2) 棉拭子在细胞维持液中多次与容器壁挤压，使病毒粒子释放到细胞维持液中，弃去 棉拭子，含有病毒粒子的细胞维持液作为被检样品备用； 3) 弃去6孔细胞培养板中的细胞生长液，加入2-3mL细胞维持液，将0.3mL-0.5mL被检样 品加入6孔板的其中一孔，37°C、5% C02培养箱培养； 4) 接种后第7日，显微镜下观察6孔细胞培养板，统计各孔出现、不出现CPE的情况;用间 接免疫荧光法检测6孔板中出现的CPE是否是由1型禽腺病毒感染引起的特异性CPE;出现特 异性CPE的孔所对应的被检样品病毒分离为阳性，不出现CPE的孔所对应的被检样品病毒分 离为阴性。8. -种1型禽腺病毒蛋黄抗体的制备方法，其特征在于包括如下步骤： (1) 将通过权利要求1-5任一项所述的方法制备得到的1型禽腺病毒疫苗多次免疫产蛋 鸡，以微量中和试验法测定蛋黄抗体效价，效价达到1:1000-1:10000以上时，收集鸡蛋； (2) 分离蛋黄，提取蛋黄抗体，使用甲醛或二乙烯亚胺灭活蛋黄抗体； (3) 用微量中和试验法测定蛋黄抗体效价，并将蛋黄抗体用PBS或生理盐水稀释使其效 价达到预防或治疗剂量，得到1型禽腺病毒蛋黄抗体。9. 一种1型禽腺病毒蛋黄抗体，其特征在于:通过权利要求8所述的方法制备得到。
【文档编号】C07K16/02GK106075427SQ201610506517
【公开日】2016年11月9日
【申请日】2016年6月30日
【发明人】李晶梅, 漆世华, 谢红玲, 温文生, 朱薇, 秦红刚, 冯钊, 王焕君, 王碧群, 靖志强, 李婷婷
【申请人】武汉中博生物股份有限公司