一种小鹅瘟病毒疫苗的制作方法
【专利摘要】本发明的目的是提供一种番鸭源小鹅瘟病毒灭活疫苗，包括有抗原和疫苗佐剂，其所用的抗原为灭活的番鸭源小鹅瘟病毒，使用的番鸭源小鹅瘟病毒的保藏编号为CCTCC NO:V201620。本发明通过筛选出具有毒性小，免疫原性高的番鸭源小鹅瘟病毒YBGPV?M株。再接种鸭胚后收取感染的胚体和尿囊液，经匀浆、超滤浓缩、甲醛溶液灭活后，加油佐剂混合乳化制成疫苗。本发明制备的疫苗免疫种番鸭能提高种番鸭的抗体水平，保证其子代母源抗体水平，预防番鸭源小鹅瘟病毒引起的雏番鸭小鹅瘟病毒感染；免疫1日龄雏番鸭，10天就可产生抗体，能有效预防番鸭源小鹅瘟病毒引起的雏番鸭小鹅瘟病毒感染。制备的疫苗具有高效、安全性好优点。CCTCC NO:V20162020160331
【专利说明】
一种小鹅瘟病毒疫苗
技术领域
[0001] 本发明属于病源微生物筛选技术领域，具体涉及一种小鹅瘟病毒灭活疫苗。
【背景技术】
[0002] 鹅细小病毒病又称Derzsy氏病，俗称鹅流感、鹅或小鹅瘟、鹅肝炎、鹅肠炎等，是一 种侵害幼鹅和番鸭的一种高度接触传染性疾病，病名的多样性反映了该病多个病理学特 征。根据感染雏鹅、雏鸭的日龄不同，该病可表现为急性、亚急性和慢性型。急性型可引起10 日龄以内的雏鹅100%死亡。许多国家也报道了一种抗原性完全不同的番鸭细小病毒感染， 死亡率高达80%。该病主要发生于1~3周龄的雏鹅和雏番鸭，尤其是1周龄左右的更易感，4 周龄以上的鹅或番鸭感染后，很少表现临床症状。本病最早于20世纪60年代中后期出现于 中国和许多欧洲国家，直到1978年才将该病称为鹅细小病毒感染，但是通过病毒中和试验、 分子生物学研究证明，从鹅和番鸭分离到的细小病毒有明显的差异。如果对死亡的番鸭处 理不当，往往造成病毒的蔓延，产生更大的危害。因此，就需要筛选出效价高、免疫原性好的 番鸭源小鹅瘟病毒来制备疫苗。而且，由于病毒变异导致使用的疫苗效价降低，也需要筛选 出变异的病毒株来制备疗效更高的疫苗。
【发明内容】
[0003] 本发明的目的是提供一种番鸭源小鹅瘟病毒灭活疫苗及其应用;所提供的疫苗具 有尚效、安全性好、保护率尚的优点，从而弥补现有技术的不足。
[0004] 本发明的番鸭源小鹅瘟病毒灭活疫苗，包括有抗原和疫苗佐剂，其所用的抗原为 灭活的番鸭源小鹅瘟病毒，使用的番鸭源小鹅瘟病毒，为番鸭源小鹅瘟病毒YBGPV-M株，于 2016年3月31日保藏在中国典型培养物保藏中心（地址：中国武汉武汉大学），保藏编号为 CCTCC NO:V201620。
[0005] 其中的番鸭源小鹅瘟病毒是经过甲醛溶液灭活的；
[0006] 上述的疫苗中番鸭源小鹅瘟病毒的含量应不低于106'5()ELD50;
[0007] 上述灭活疫苗的制备方法如下：
[0008] 1)油相制备:取兽用白油95份，硬脂酸铝1份，置于油相制备罐中加热至80°C后，再 加5份司本-80,至温度达到115°C时，维持30min，冷却后备用；
[0009] 2)水相制备:将灭活的YBGPV-M株病毒液加入水中，使每0.2ml水中含YBGPV-M株病 毒含量不低于1〇6·5t3ELD5O;取灭菌后的5份吐温-80，加入配液罐中，同时加入病毒液95份，搅 拌20~30min，使吐温-80完全溶解；
[0010] 3)乳化:取油相2份放于高速剪切机内，开动电机慢速转动搅拌，同时徐徐加入水 相1份，以l〇〇〇〇r/min，乳化5分钟，乳化后，取IOml，以3000r/min离心15分钟完成制备。
[0011] 本发明通过筛选出具有病毒含量高，免疫原性好的番鸭源小鹅瘟病毒YBGPV-M株。 再接种鸭胚后收取感染的胚体和尿囊液，经匀浆、超滤浓缩、甲醛溶液灭活后，加油佐剂混 合乳化制成疫苗。本发明制备的疫苗免疫种番鸭能提高种番鸭的抗体水平，保证其子代母 源抗体水平，预防番鸭源小鹅瘟病毒引起的雏番鸭小鹅瘟病毒感染;免疫1日龄雏番鸭，10 天就可产生抗体，能有效预防番鸭源小鹅瘟病毒引起的雏番鸭小鹅瘟病毒感染。制备的疫 苗具有高效、安全性好优点。
【附图说明】
[0012] 图1:基于VP基因的YBGPV-M与国内外已公布的GPV毒株遗传进化树图。
【具体实施方式】
[0013] 下面结合具体实施例对本发明进行详细的描述。本发明所应用的方法可以采用疫 苗制备领域中常用的方法，而不仅限于本发明实施例的具体记载，本领域的普通技术人员 可以其它常规方法来实现本发明。
[0014] 实施例1、YBGPV-M株的筛选
[0015] 2013年从福建省某鸭场的雏番鸭群中出现了以腹泻、部分鸭肠粘膜脱落形成栓塞 为主要特征的疫病，发病率50 %~80 %，病死率45 %~70 %，临床上使用抗菌素、番鸭细小 病毒病疫苗及番鸭细小高免卵黄抗体均不能控制病情。发明人无菌采集濒死鸭的肝脏、脾 脏及胰腺，将肝脏、脾脏及胰腺用无菌生理盐水匀浆制成20 %悬液，3000r/min离心15min， 取上清除菌后经尿囊腔分别接种11日龄番鸭胚，孵化168小时，收集24小时后死亡胚的尿囊 液及胚体组织，经匀浆后，反复冻融3次，取上清液冻存。收获的病毒液经纯化后进行了病毒 含量、免疫原性、特异性及纯净性等方面的病毒特性的分析检测，结果表明该毒株病毒含量 为10 6'5()ELD5()/0.2ml，最小免疫剂量为H^ELDm/OH，该病毒仅与小鹅瘟病毒发生特异性 反应，无细菌、支原体及外源病毒污染，适合作为制苗用毒株。将筛选的病毒株于2016年3月 31日保藏在中国典型培养物保藏中心（地址：中国武汉武汉大学），保藏编号为CCTCC NO: V201620。
[0016] 对于本发明筛选的毒株的性状进行检测，结果表明，该株病毒属细小病毒，圆形无 囊膜，直径在20~22nm左右、对理化因素的灭活作用有很强的抵抗力65°C加热处理30min病 毒滴度不受影响，37 °C作用1小时仍稳定，对乙醚、胰蛋白酶、酸不敏感，对红细胞无凝集现 象。该病毒可引起雏番鸭发生以腹泻、部分鸭肠粘膜脱落形成栓塞为特征疫病。该毒株制备 的疫苗免疫1日龄雏番鸭，10天就可产生抗体，免疫期可达6个月以上;免疫成年番鸭后，能 保护免疫6个月内种番鸭所产子代免受流行毒株的攻击。该毒株作100倍稀释后，与等量番 鸭源小鹅瘟病毒抗血清中和，接种11日龄番鸭胚，结果表明，中和组番鸭胚全部健活，而病 毒对照组番鸭胚全部死亡。
[0017] 对筛选鉴定的YBGPV-M株的结构蛋白基因 VP进行了测序，VP基因全长2199bp，编码 约732个氨基酸;将其与GenBank中收录的30个GPV VP基因序列进行遗传进化树（图1)及核 苷酸序列同源性分析，发现本发明获得YBGPV-M株VP基因与另外30个GPV毒株的VP基因同源 性介于85.9 %~90.3 %之间；结果表明筛选病毒的VP蛋白与已报道的小鹅瘟病毒VP基因存 在着氨基酸差异。
[0018] 实施例2制备疫苗
[0019] 1.制苗用病毒液的制备将生产用毒种YBGPV-M株用无菌生理盐水稀释100倍，尿囊 腔接种11~12日龄易感番鸭胚，每胚0.2ml，37°C孵育，每日2次照胚检查。选择接种后48~ 168小时内死亡的鸭胚，置2~8 °C4~12小时，无菌条件下打开气室，挑取胚体有广泛出血， 毛囊出血，肝脏变性和坏死，绒毛尿囊膜有轻度水肿的胚，取其胚体(去掉头和四肢)放入组 织捣碎机中粉碎，收取尿囊液、羊水，用胚液匀浆，取粉碎后的组织按1:3加入生理盐水混 合，冻融3次，4000r/min离心30min，取上清混合于无菌容器中，置2~8°C保存。
[0020] 2.灭活将YBGPV-M株病毒液置于灭活瓶内，计量加入10%甲醛溶液，随加随摇，使 其充分混合，甲醛溶液的最终浓度为0.2%。加甲醛溶液后倒入另一灭活瓶中，以避免瓶口 附近粘附的病毒未能接触灭活剂。37°C灭活16小时后取出，置2~8°C保存。
[0021] 3.半成品检验
[0022] (1)无菌检验取灭活的胚液，按现行《中国兽药典》附录进行无菌检验。
[0023] (2)病毒含量测定将病毒液用灭菌生理盐水作10倍系列稀释，取10-3、10-4、10' HT6 4个稀释度，分别尿囊腔接种11~12日龄易感番鸭胚，每胚0.2ml，同时设接种生理盐水 对照5枚，每胚0.2ml。置37°C继续孵育，每日照胚2次，观察168小时。以鸡胚死亡并出现尿囊 膜水肿增厚，头、颈、背部等全身出血性病变判为感染，计算ELD 50。
[0024] (3)灭活检验将YBGPV-M株灭活后的病毒液尿囊腔接种11~12日龄易感番鸭胚10 枚，每胚0.2ml，置37°C继续孵育，连续观察168小时。
[0025]三、灭活疫苗的制备:经过检验合格后的半成品抗原进行疫苗制备（以下配制中各 液体成分按体积比计）。
[0026] (1)油相制备取兽用白油95份，硬脂酸铝1份，置于油相制备罐中加热至80°C后，再 加司本一80 5份，至温度达到115 °C时，维持30min，冷却后备用。
[0027] (2)水相制备将灭活检验合格的YBGPV-M株病毒液与无菌生理盐水适当比例混合， 使每0.2ml水相中含YBGPV-M株病毒含量不低于104· 5ELD5q。取灭菌后的吐温-80 5份，加入配 液罐中，同时加混合抗原液95份，开动搅拌电机搅拌20~30min，使吐温-80完全溶解。
[0028] (3)乳化取油相2份放于高速剪切机内，开动电机慢速转动搅拌，同时徐徐加入水 相1份，以l〇〇〇〇r/min，乳化5分钟。乳化后，取IOml，以3000r/min离心15分钟，管底析出的水 相应不超过0.5ml。
[0029] 四、疫苗成品检验 [0030] (1)性状
[0031] 外观疫苗应为乳白色乳剂，无杂质并且外包装应合格。
[0032] 剂型为油包水型。取一清洁吸管，吸取少量疫苗滴入冷水中，除第1滴外，均应不扩 散。
[0033] 稳定性吸取疫苗IOml加入离心管中，以3000r/min离心15分钟，管底析出的水相应 不超过0.5ml。
[0034]黏度按现行《中国兽药典》附录进行，应符合规定。
[0035] (2)装量检查按现行《中国兽药典》附录进行，应符合规定。
[0036] (3)无菌检验按现行《中国兽药典》附录进行，应符合规定。
[0037] (4)安全检验用1日龄健康易感雏番鸭10只，每只颈部皮下注射疫苗2.0ml(左右各 1.0ml)，同时设对照5只，在相同的条件下饲养，连续观察20日，记录试验鸭采食、饮水及临 床情况。应不出现由疫苗引起的任何局部和全身不良反应。
[0038] (5)效力检验
[0039] ①免疫攻毒法取1日龄雏番鸭20只，随机分成两组，每组10只，其中一组每只颈部 皮下注射疫苗，〇.2ml/只，另一组10只同日龄雏番鸭不免疫作对照，隔离饲养。于免疫后15 日免疫组和对照组同时攻击雏鸭源小鹅瘟病毒YBGPV-M株，每只颈部皮下注射0.2ml/只 (10 6'5()ELD5()/0.2ml)，连续观察15日，免疫组鸭均应至少8只保护，对照组鸭均应至少9只发 病。
[0040] ②子代母源抗体与攻毒保护的关系90日龄种番鸭20只，每只颈部皮下注射疫苗， 2.Oml/只，另取10只同日龄种番鸭不免疫作对照。于免疫后15日相同途径相同剂量再免疫 一次，收集开产后4月时所产种蛋孵化出雏，于雏番鸭1日龄时，免疫组子代取10只，对照组 子代取10只，攻毒YBGPV-M株，每只肌肉注射0.2ml。免疫组子代保护率应不低于8只，对照组 发病率应不低于9只。
[0041] ③对地方流行毒株的攻毒保护(毒株的筛选)将各地方流行毒株分别制备灭活疫 苗，取90日龄种番鸭20只，每只颈部皮下注射疫苗，2.Oml/只，另取10只同日龄种番鸭不免 疫作对照。于免疫后15日相同途径相同剂量再免疫一次，收集开产1个月内所产种蛋孵化出 雏，于雏番鸭1日龄时，免疫组子代取10只，对照组子代取10只，攻毒6株各地方分离株，每只 肌肉注射0.2ml。观察攻毒保护情况。
[0042] 实施例3
[0043] -、制苗用抗原的制备
[0044] 1.制苗用病毒液的制备将生产用毒种YBGPV-M株用无菌生理盐水稀释100倍，尿囊 腔接种11~12日龄易感番鸭胚，每胚0.2ml，37°C孵育，每日2次照胚检查。选择接种后48~ 168小时内死亡的鸭胚，置2~8 °C4~12小时，无菌条件下打开气室，挑取胚体有广泛出血， 毛囊出血，肝脏变性和坏死，绒毛尿囊膜有轻度水肿的胚，取其胚体(去掉头和四肢)放入组 织捣碎机中粉碎，收取尿囊液、羊水，用胚液匀浆，取粉碎后的组织按1:3加入生理盐水混 合，冻融3次，4000r/min离心30min，取上清混合于无菌容器中，置2~8°C保存。（参见表1)。
[0045] 表1毒液的制备
[0047] 2.灭活将病毒液倒入灭活瓶内，计量加入10 %甲醛溶液，使其充分混合，甲醛溶液 的最终浓度为0.2%。加甲醛溶液后倒入另一灭活罐中，以避免罐口附近粘附的病毒未能接 触灭活剂。37°C灭活16小时后取出，置2~8°C保存。
[0048] 3.疫苗半成品检验
[0049] (1)无菌检验取灭活的胚液，按现行《中国兽药典》附录进行，无菌生长。
[0050] (2)病毒含量测定将病毒液用灭菌生理盐水作10倍系列稀释，取10-3、10- 4、10-5、 HT6 4个稀释度，分别尿囊腔接种11~12日龄易感番鸭胚，每胚0.2ml，同时设接种生理盐水 对照5枚，每胚0.2ml。置37°C继续孵育，每日照胚2次，观察168小时。以鸡胚死亡并出现尿囊 膜水肿增厚，头、颈、背部等全身出血性病变判为感染，计算ELD 5q为106· 67ELD5Q/0.2ml。
[0051 ] (3)灭活检验将病毒液尿囊腔接种11~12日龄易感番鸭胚10枚，每胚0.2ml，置37 °(：继续孵育，连续观察168小时，鸭胚均无死亡。
[0052]二、灭活疫苗的制备:经过检验合格后的半成品抗原进行疫苗制备（以下配制中各 液体成分按体积比计，参见表2)。
[0053] (1)油相制备取兽用白油95份，硬脂酸铝1份，置于油相制备罐中加热至80°C后，再 加司本一80 5份，至温度达到115 °C时，维持30min，冷却后备用。
[0054] (2)水相制备将灭活检验合格的病毒液混合，检测每0.2ml水相中含YBGPV-M株病 毒含量不低于106'5()ELD5()。取灭菌后的吐温-80 5份，加入配液罐中，同时加混合抗原液95 份，开动搅拌电机搅拌20~30min，使吐温-80完全溶解。
[0055] (3)乳化取油相2份放于高速剪切机内，开动电机慢速转动搅拌，同时徐徐加入水 相1份，以l〇〇〇〇r/min，乳化5分钟。乳化后，取IOml，以3000r/min离心15分钟，管底无水相析 出。
[0056] (4)分装定量分装，加盖密封。
[0057]表2疫苗乳化和分装
[0059]三、疫苗成品检验
[0060] (1)性状
[0061]外观乳白色乳剂。
[0062] 剂型油包水型，取一清洁吸管，吸取少量疫苗滴于冷水，呈油滴状不扩散。
[0063] 稳定性吸取疫苗IOml加入离心管中，以3000r/min离心15分钟，管底无水相析出。 [0064]黏度按现行版《中国兽药典》附录进行，为58.6cp。
[0065] (2)装量检查按现行版《中国兽药典》附录进行，符合标准。
[0066] (3)无菌检验按现行版《中国兽药典》附录进行，无菌生长。
[0067] (4)安全检验用1日龄雏番鸭10只，每只颈部皮下注射疫苗2.0ml(左右各1.0ml)， 同时设对照5只，在相同的条件下饲养，连续观察20日，记录试验鸭采食、饮水及临床情况。 应不出现由疫苗引起的任何局部和全身不良反应。
[0068] (5)效力检验
[0069]①1日龄雏番鸭20只，随机分成两组，每组10只，其中一组每只颈部皮下注射疫苗， 0.2ml/只，另一组10只同日龄雏番鸭不免疫作对照，隔离饲养。于免疫后15日免疫组和对照 组同时攻击雏鸭源小鹅瘟病毒YBGPV-M株，每只颈部皮下注射0.2ml/只（10 6· 5t3ELD50/ 0.2ml)，连续观察15日，结果免疫组鸭9只保护，对照组鸭10只全部发病。（见表3)。
[0070]表3疫苗效力检验结果
[0072]②子代母源抗体与攻毒保护的关系90日龄种番鸭20只，每只颈部皮下注射疫苗， 2.Oml/只，另取10只同日龄种番鸭不免疫作对照。于免疫后15日相同途径相同剂量再免疫 一次，收集开产后4月时所产种蛋孵化出雏，于雏番鸭7日龄时，免疫组子代取10只，对照组 子代取10只，攻毒YBGPV-M株，每只肌肉注射0.2ml。免疫组子代保护9只，对照组全部发病。 [0073]③对地方流行毒株的攻毒保护(毒株的选育)90日龄种番鸭20只，每只颈部皮下注 射疫苗，2.Oml/只，另取10只同日龄种番鸭不免疫作对照。于免疫后15日相同途径相同剂量 再免疫一次，收集开产1个月内所产种蛋孵化出雏，于雏番鸭7日龄时，免疫组子代取10只， 对照组子代取10只，攻毒6株各地方分离株，每只肌肉注射0.2ml。结果表明，用YBGPV-M株制 备的番鸭小鹅瘟灭活疫苗相比较其它毒株制备的灭活疫苗，能抵御各地方分离毒的攻击 (参见表4)。此外，用YBGPV-M株制备的番鸭小鹅瘟灭活疫苗对于YBGPV-M株的攻毒实验表 明，YBGPV-M株制备的疫苗的免疫效果最好，推测是由于YBGPV-M株基因发生变异导致的。 [0074]表4对地方流行毒株的攻毒保护
[0077]上述结果表明，本发明制备的疫苗能有效的预防目前各地流行的番鸭小鹅瘟的感 染，且对于初发的抗原病毒具有更佳的免疫效果。
【主权项】
1. 一种番鸭源小鹅瘟病毒灭活疫苗，其特征在于，所述的灭活疫苗包含有抗原和疫苗 佐剂，其所用的抗原为灭活的番鸭源小鹅瘟病毒，其保藏编号为CCTCC N0:V201620。2. 如权利要求1所述的灭活疫苗，其特征在于，所述的番鸭源小鹅瘟病毒经过甲醛溶液 灭活。3. 如权利要求1所述的灭活疫苗，其特征在于，所述的疫苗中番鸭源小鹅瘟病毒的含量 不低于 l〇6'5°ELD50。4. 权利要求1所述的灭活疫苗的制备方法，其特征在于，所述的方法包括如下的步骤： 1) 油相制备：取兽用白油95份，硬脂酸铝1份，置于油相制备罐中加热至80°C后，再加5 份司本-80，至温度达到115 °C时，维持30min，冷却后备用； 2) 水相制备：将灭活的番鸭源小鹅瘟病毒液加入水中，使每0.2ml水中含YBGPV-M株病 毒含量不低于1〇6· 5()ELD5();取灭菌后的5份吐温-80，加入配液罐中，同时加入病毒液95份，搅 拌20~30min，使吐温-80完全溶解； 3) 乳化：取油相2份放于高速剪切机内，开动电机慢速转动搅拌，同时徐徐加入水相1 份，以10000r/min，乳化5分钟，乳化后，取10ml，以3000r/min离心15分钟完成制备。
【文档编号】A61P31/20GK106075426SQ201610438620
【公开日】2016年11月9日
【申请日】2016年6月18日
【发明人】邹敏, 吴发兴, 宫晓, 王龙, 刘新文, 李芳 , 范根成
【申请人】青岛易邦生物工程有限公司