一种A群C群脑膜炎球菌b型流感嗜血杆菌联合疫苗的制备方法
【专利摘要】本发明公开了一种A群C群脑膜炎球菌b型流感嗜血杆菌联合疫苗的制备方法，该方法包括：S1.制备单价疫苗原液；S2.制备联合疫苗；S3.冻干。本发明提供了一种A群C群脑膜炎球菌b型流感嗜血杆菌联合疫苗的制备方法，该方法将A群、C群脑膜炎球菌与b型流感嗜血杆菌疫苗结合起来，制备的联合疫苗效果显著，由于为联合疫苗，因此该疫苗减少了接种次数，降低婴幼儿创伤，降低了接种成本，具有良好的社会和经济效益；本发明的方法具有操作简单、制备方便、成本低、适用于工业化大规模生产。
【专利说明】
一种A群C群脑膜炎球菌b型流感嗜血杆菌联合疫苗的制备方法
技术领域
[0001]本发明属于生物技术领域，具体涉及一种A群C群脑膜炎球菌b型流感嗜血杆菌联合疫苗的制备方法。
【背景技术】
[0002]流行性脑脊髓膜炎是一种由奈瑟氏脑膜炎球菌(Neisseriameningitidis)引起的急性呼吸道传染病。一百多年来，一直在世界各地流行或散在发生，感染病原菌后可引起败血症、脑膜炎。易感人群主要为儿童，以暴发型病死率最高，可达40%?60%。当今世界各大洲发病率在1/10万?10/10万，总病死率在5%?15%，高达20%的脑膜炎患者会有神经系统后遗症，包括智力受损和耳聋等。
[0003]脑膜炎球菌根据荚膜多糖型别进行血清学分类可分13个血清型，其中A群，B群，C群约占流行菌群的90%。其中A群脑膜炎球菌是较大流行的主要致病血清群，特别是在所谓的非洲“流脑流行带”，每隔7?14年就会出现一次较大流行，引起儿童和年轻成人超额发病率与死亡率。近年来，一些西方国家则出现过C群引起的流脑爆发。我国于1938年、1949年、1959年、1967年和1977年发生过5次全国性流脑流行。其中以1967年春季最为严重，发病率高达403/10万，病死率为5.49%。我国过去90%以上的病例是A群病菌致病，现在B群或C群病菌有时亦引起流脑暴发。2003年开始，C群流脑的发病率明显上升。目前A群和C群共占所有血清群的50%以上，且C群仍有进一步增高的趋势。
[0004]即使是在医疗条件比较完善的地方，流脑病死率仍然很高(5-15%)。一般来说，仅靠药物预防措施来控制此病是不够的。目前预防流脑最有效的方法是接种疫苗。我国从2007年起已将流脑疫苗纳入国家免疫规划，在全国范围对适龄儿童普及接种。
[0005]流感嗜血杆菌(Haemophilus Influenza，Hi)迄今仍是导致人类侵袭性疾病的主要致病菌，其中绝大部分由b型流感嗜血杆菌(Haemophilus Influenza type b，Hib)引起。Hib脑膜炎居细菌性脑膜炎的首位，具有发病率高、病死率高和致残率高的特点；其另一个特点是发病年龄小，婴幼儿感染率高，发病年龄主要集中在5岁以下，尤其是2岁以下。全世界估计每年至少造成300万例严重疾病，其中约38.6万人死亡，已成为全球性的一大公共卫生问题。
[0006]在发展中国家，Hib肺炎在儿童感染性疾病中占有重要地位，约占所有儿童肺炎的20%，是发展中国家儿童肺炎的重要死亡原因。上世纪90年代初，西欧、美洲等国家将Hib结合疫苗纳入常规儿童免疫规划，Hib侵袭性疾病的发病率迅速降低或消失。目前，世界卫生组织(WHO)正致力于推动将其纳入其它国家的计划免疫程序中。在我国，3?5岁儿童中Hib自然感染抗体水平低，为Hib感染高危人群。我国医院临床研究提示，Hib脑膜炎在小儿化脓性脑膜炎中占51.7%，其中84%为2岁以下儿童;儿童中Hib肺炎占34.3%，因此我国有使用Hib结合疫苗的必要。
[0007]目前在全世界可通过免疫接种来预防的疾病已经达三十多种，其中大部分是针对儿童接种。自1974年WHO推行扩大免疫计划以来，疫苗的接种覆盖率得到大大提高，接种次数也不断增加。据统计，儿童入学前需接受预防接种21次左右，在未来还会有新的疫苗不断研究和开发出来，因此儿童免疫计划表中的疫苗种类也会随之增加。为了在儿童期有限的时间内减少接种次数同时又能预防更多疾病，迫切需要研究开发联合疫苗。
[0008]联合疫苗较以往的单价疫苗有很多优势，如更少的接种次数，降低婴幼儿创伤;提高国家免疫计划表的实施效率，减少漏种;更高的免疫覆盖率;更低的空间存放要求;便于未来增加新品种疫苗到免疫计划表中。因此从某种意义上说，联合疫苗在预防传染病的作用中代表了未来疫苗的发展方向。
【发明内容】
[0009]本发明的目的在于克服现有技术的缺点，提供一种A群C群脑膜炎球菌b型流感嗜血杆菌联合疫苗的制备方法。
[0010]本发明的目的通过以下技术方案来实现:一种A群C群脑膜炎球菌b型流感嗜血杆菌联合疫苗的制备方法，它包括以下步骤:
51.制备单价疫苗原液:包括制备A群脑膜炎球菌结合疫苗原液、制备C群脑膜炎球菌结合疫苗原液、制备b型流感嗜血杆菌结合疫苗原液；
52.制备联合疫苗:将制备的A群脑膜炎球菌结合疫苗原液、C群脑膜炎球菌结合疫苗原液、b型流感嗜血杆菌结合疫苗原液按重量比为1:1:1的比例混合均匀，混合液中加入乳糖，至结合多糖的含量为30yg/0.5mL;
53.冻干:将冻干机的板层降温至-45?-55°C，步骤S2制备的联合疫苗制品预冻3.5?
4.5h，预冻后抽真空至0.05?0.08mbar保持1.5?2.5h，采用三段升温O°C保持1.5?2.5h，
温持续升温至28?35°C，制品温度达到28?30°C后打开真空控制维持温度保持15?25h，冻干结束后充氮气压盖出柜，即制得联合疫苗。
[0011]进一步地，步骤S2中A群脑膜炎球菌结合多糖为10yg/0.5mL、C群脑膜炎球菌结合多糖为10yg/0.5mL、b型流感嗜血杆菌结合多糖为10yg/0.5mL。
[0012]进一步地，步骤S3中所述三段升温的第一段温度为-50?_30°C、第二段温度为-30?-20°C、第三段温度为-20?O °C。
[0013]本发明具有以下优点:本发明提供了一种A群C群脑膜炎球菌b型流感嗜血杆菌联合疫苗的制备方法，该方法将A群、C群脑膜炎球菌与b型流感嗜血杆菌疫苗结合起来，制备的联合疫苗效果显著，由于为联合疫苗，因此该疫苗减少了接种次数，降低婴幼儿创伤，降低了接种成本，具有良好的社会和经济效益;本发明的方法具有操作简单、制备方便、成本低、适用于工业化大规模生产。
【具体实施方式】
[0014]下面结合实施例对本发明做进一步的描述，本发明的保护范围不局限于以下所述。
[0015]实施例1:一种A群C群脑膜炎球菌b型流感嗜血杆菌联合疫苗的制备方法，它包括以下步骤:
S1.制备单价疫苗原液:包括制备A群脑膜炎球菌结合疫苗原液、制备C群脑膜炎球菌结合疫苗原液、制备b型流感嗜血杆菌结合疫苗原液；
511.制备A群脑膜炎球菌结合疫苗原液
开启A群脑膜炎球菌工作种子批菌种，接种至流脑半综合培养基，温度35?37°C，培养16?24小时，然后经过三代扩增培养，制备数量适宜的生产用种子，接种至500L发酵罐培养，温度35?37°C，培养时间6?12小时后加入甲醛杀菌；
将已杀菌的培养液离心收集上清，然后加入十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)至终浓度1.0g/L，充分搅拌后静置过夜，离心收集多糖。沉淀的多糖用氯化钙溶液搅拌3小时使多糖和CTAB解离，离心收集上清，上清加入乙醇至终浓度为25%( v/v)，2?8°C静置过夜，离心收集上清，上清加入乙醇至终浓度为75?80%(v/v)，充分振摇使多糖沉淀，静置18小时以上，离心收集沉淀，然后用无水乙醇和丙酮各洗三次，干燥后即为粗制多糖；
将粗糖溶解于10%饱和中性醋酸钠溶液中。然后按1: l(v/v)比例加入冷酚溶液，振荡混匀后离心收集上清液，抽提I?3次至上清液澄清，收集上清液，用超滤膜包超滤去除残余的苯酚及核酸，超滤后的多糖溶液中加入4mol/L NaCl溶液，至NaCl终浓度为0.3mol/L，然后加入95%乙醇至乙醇终浓度为75%(v/v)，充分混匀后2?8°C静置过夜，沉淀精糖，离心收集沉淀，然后依次用无水乙醇、丙酮各洗涤两次，干燥后即为精糖；
将精糖溶解于注射用水中，按多糖:溴化氰=1: 0.5(w/w)的比例加入溴化氰溶液，维持温度23±3°C，pH1.8±0.2反应30分钟进行活化，活化完成后，按多糖:己二酰肼=1:3.5(w/w)的比例加入2.8%己二酰肼溶液，维持温度23 ± 3 °C，pH8.5 ± 0.2反应15分钟进行衍生；澄清过滤后，用0.05mol/L氯化钠溶液为超滤液，用超滤膜包超滤去除溴化氰，即为多糖衍生物。；
按多糖:蛋白=1:0.8?1.2(w/w)的比例计算破伤风类毒素用量，加入多糖衍生物溶液中，按多糖:碳二亚胺=1:10(w/w)的比例加入碳二亚胺，维持反应温度5 ± 3°C ; pH5.7 ±0.2，反应60分钟，然后调节pH至6.9±0.1终止反应。经澄清过滤后，用0.15mol/L氯化钠溶液为超滤液，用超滤膜包超滤去除碳二亚胺。然后将多糖蛋白结合物溶液用Sepharose 4FF凝胶层析柱纯化。以0.15mol/L NaCl溶液为流动相，监测0D280nm的吸收值，收集Vo附近的洗脱峰。合并各次层析收获的洗脱液后即为纯化的结合物，经除菌过滤后，即为A群脑膜炎球菌结合疫苗原液；
512.制备C群脑膜炎球菌结合疫苗原液
开启C群脑膜炎球菌工作种子批菌种，接种至流脑半综合培养基，温度35?37°C，培养16?24小时，然后经过三代扩增培养，制备数量适宜的生产用种子，接种至500L发酵罐培养，温度35?37°C，培养时间6?12小时后加入甲醛杀菌；
将已杀菌的培养液离心收集上清。然后加入十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)至终浓度1.0g/L，充分搅拌后静置过夜，离心收集多糖。沉淀的多糖用氯化钙溶液搅拌3小时使多糖和CTAB解离。离心收集上清，上清加入乙醇至终浓度为25%(v/v)，2?8°C静置过夜，离心收集上清，上清加入乙醇至终浓度为75?80%(v/v)，充分振摇使多糖沉淀，静置18小时以上，离心收集沉淀，然后用无水乙醇和丙酮各洗三次，干燥后即为粗制多糖；
将粗糖溶解于10%饱和中性醋酸钠溶液中。然后按1: l(v/v)比例加入冷酚溶液，振荡混匀后离心收集上清液，抽提I?3次至上清液澄清。收集上清液，用超滤膜包超滤去除残余的苯酚及核酸。超滤后的多糖溶液中加入4mol/L NaCl溶液，至NaCl终浓度为0.3mol/L，然后加入95%乙醇至乙醇终浓度为75%(v/v)，充分混匀后2?8°C静置过夜，沉淀精糖。离心收集沉淀，然后依次用无水乙醇、丙酮各洗涤两次，干燥后即为精糖；
将精糖溶解于注射用水中。按多糖:溴化氰=1:0.5(w/w)的比例加入溴化氰溶液。维持温度23±3°C，pH10.8±0.2反应30分钟进行活化。活化完成后，按多糖:己二酰肼=1:3.5(w/w)的比例加入2.8%己二酰肼溶液。维持温度23 ± 3 °C，pH8.5 ± 0.2反应15分钟进行衍生。澄清过滤后，用0.05mol/L氯化钠溶液为超滤液，用超滤膜包超滤去除溴化氰，即为多糖衍生物。
[0016]按多糖:蛋白=1:0.8?1.2(w/w)的比例计算破伤风类毒素用量，加入多糖衍生物溶液中，按多糖:碳二亚胺=1: 10(w/w)的比例加入碳二亚胺，维持反应温度5 ±3°C ;pH5.7 土
0.2，反应60分钟，然后调节pH至6.9±0.1终止反应。经澄清过滤后，用0.15mol/L氯化钠溶液为超滤液，用超滤膜包超滤去除碳二亚胺。然后将多糖蛋白结合物溶液用Sepharose 4FF凝胶层析柱纯化。以0.15mol/L NaCl溶液为流动相，监测0D280nm的吸收值，收集Vo附近的洗脱峰。合并各次层析收获的洗脱液后即为纯化的结合物，经除菌过滤后，即为C群脑膜炎球菌结合疫苗原液；
S13.制备b型流感嗜血杆菌结合疫苗原液
开启b型流感嗜血杆菌工作种子批菌种，接种至Hib综合培养基，温度35?37 °C，5?8%CO2环境中，培养16?24小时，然后经过三代扩增培养，制备数量适宜的生产用种子，接种至500L发酵罐培养，温度35?37°C，培养时间6?12小时后加入甲醛杀菌；
将已杀菌的培养液离心收集上清，然后加入十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)至终浓度I.0g/L，充分搅拌后静置过夜，离心收集多糖;沉淀的多糖用氯化钠溶液搅拌3小时使多糖和CTAB解离。离心收集上清，上清加入乙醇至终浓度为25%(v/v)，2?8°C静置过夜，离心收集上清，上清加入乙醇至终浓度为75?80%( v/v)，充分振摇使多糖沉淀，静置过夜，离心收集沉淀，用无水乙醇和丙酮各洗三次，干燥后即为粗制多糖；
将粗糖溶解于10%饱和中性醋酸钠溶液中，然后按1: l(v/v)比例加入冷酚溶液，振荡混匀后离心收集上清液，抽提I?3次至上清液澄清;收集上清液，用超滤膜包超滤去除残余的苯酚及核酸;超滤后的多糖溶液中加入4mol/L NaCl溶液，至NaCl终浓度为0.3mol/L，然后加入95%乙醇至乙醇终浓度为75%(v/v)，充分混匀后2?8°C静置过夜，沉淀精糖。离心收集沉淀，然后依次用无水乙醇、丙酮各洗涤两次，干燥后即为精糖。
[0017]将精糖溶解于注射用水中。按多糖:溴化氰=1:0.5(w/w)的比例加入溴化氰溶液。维持温度23 ± 3 °C，pH10.8 ± 0.2反应30分钟进行活化。活化完成后，按多糖:己二酰肼=1:3.5(w/w)的比例加入2.8%己二酰肼溶液。维持温度23 ± 3°C，pH8.5 ±0.2反应15分钟进行衍生。澄清过滤后，用0.05mol/L氯化钠溶液为超滤液，用超滤膜包超滤去除溴化氰，即为多糖衍生物。
[0018]按多糖:蛋白=1:0.8?1.2(w/w)的比例计算破伤风类毒素用量，加入多糖衍生物溶液中，按多糖:碳二亚胺=1: 10(w/w)的比例加入碳二亚胺，维持反应温度5 ±3°C ;pH5.7 土
0.2，反应60分钟，然后调节pH至6.9±0.1终止反应。经澄清过滤后，用0.15mol/L氯化钠溶液为超滤液，用超滤膜包超滤去除碳二亚胺。然后将多糖蛋白结合物溶液用Sepharose 4FF凝胶层析柱纯化。以0.15mol/L NaCl溶液为流动相，监测0D280nm的吸收值，收集VO附近的洗脱峰。合并各次层析收获的洗脱液后即为纯化的结合物，经除菌过滤后，即为b型流感嗜血杆菌结合疫苗原液；
52.制备联合疫苗:将制备的A群脑膜炎球菌结合疫苗原液、C群脑膜炎球菌结合疫苗原液、b型流感嗜血杆菌结合疫苗原液按重量比为1:1:1的比例混合均匀，混合液中加入乳糖，至结合多糖的含量为30yg/0.5mL;其中，A群脑膜炎球菌结合多糖为10yg/0.5mL、C群脑膜炎球菌结合多糖为10yg/0.5mL、b型流感嗜血杆菌结合多糖为10yg/0.5mL；
53.冻干:将冻干机的板层降温至_45°C，步骤S2制备的联合疫苗制品预冻3.5h，预冻后抽真空至0.05mbar保持1.5h，采用三段升温0°C保持1.5?2.5h，温持续升温至28°C，制品温度达到28°C后打开真空控制维持温度保持15h，冻干结束后充氮气压盖出柜，即制得联合疫苗，其中，中所述三段升温的第一段温度为-50°C、第二段温度为-30°C、第三段温度为OΓ。
[0019]实施例2:—种A群C群脑膜炎球菌b型流感嗜血杆菌联合疫苗的制备方法，它包括以下步骤:
S1.制备单价疫苗原液:包括制备A群脑膜炎球菌结合疫苗原液、制备C群脑膜炎球菌结合疫苗原液、制备b型流感嗜血杆菌结合疫苗原液；
Sll.制备A群脑膜炎球菌结合疫苗原液
开启A群脑膜炎球菌工作种子批菌种，接种至流脑半综合培养基，温度35?37°C，培养16?24小时，然后经过三代扩增培养，制备数量适宜的生产用种子，接种至500L发酵罐培养，温度35?37°C，培养时间6?12小时后加入甲醛杀菌；
将已杀菌的培养液离心收集上清，然后加入十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)至终浓度1.0g/L，充分搅拌后静置过夜，离心收集多糖。沉淀的多糖用氯化钙溶液搅拌3小时使多糖和CTAB解离，离心收集上清，上清加入乙醇至终浓度为25%( v/v)，2?8°C静置过夜，离心收集上清，上清加入乙醇至终浓度为75?80%(v/v)，充分振摇使多糖沉淀，静置18小时以上，离心收集沉淀，然后用无水乙醇和丙酮各洗三次，干燥后即为粗制多糖；
将粗糖溶解于10%饱和中性醋酸钠溶液中。然后按1: l(v/v)比例加入冷酚溶液，振荡混匀后离心收集上清液，抽提I?3次至上清液澄清，收集上清液，用超滤膜包超滤去除残余的苯酚及核酸，超滤后的多糖溶液中加入4mol/L NaCl溶液，至NaCl终浓度为0.3mol/L，然后加入95%乙醇至乙醇终浓度为75%(v/v)，充分混匀后2?8°C静置过夜，沉淀精糖，离心收集沉淀，然后依次用无水乙醇、丙酮各洗涤两次，干燥后即为精糖；
将精糖溶解于注射用水中，按多糖:溴化氰=1: 0.5(w/w)的比例加入溴化氰溶液，维持温度23±3°C，pH1.8±0.2反应30分钟进行活化，活化完成后，按多糖:己二酰肼=1:3.5(w/w)的比例加入2.8%己二酰肼溶液，维持温度23 ± 3 °C，pH8.5 ± 0.2反应15分钟进行衍生；澄清过滤后，用0.05mol/L氯化钠溶液为超滤液，用超滤膜包超滤去除溴化氰，即为多糖衍生物。；
按多糖:蛋白=1:0.8?1.2(w/w)的比例计算破伤风类毒素用量，加入多糖衍生物溶液中，按多糖:碳二亚胺=1:10(w/w)的比例加入碳二亚胺，维持反应温度5 ± 3°C ; pH5.7 ±0.2，反应60分钟，然后调节pH至6.9±0.1终止反应。经澄清过滤后，用0.15mol/L氯化钠溶液为超滤液，用超滤膜包超滤去除碳二亚胺。然后将多糖蛋白结合物溶液用Sepharose 4FF凝胶层析柱纯化。以0.15mol/L NaCl溶液为流动相，监测0D280nm的吸收值，收集Vo附近的洗脱峰。合并各次层析收获的洗脱液后即为纯化的结合物，经除菌过滤后，即为A群脑膜炎球菌结合疫苗原液；
512.制备C群脑膜炎球菌结合疫苗原液
开启C群脑膜炎球菌工作种子批菌种，接种至流脑半综合培养基，温度35?37°C，培养16?24小时，然后经过三代扩增培养，制备数量适宜的生产用种子，接种至500L发酵罐培养，温度35?37°C，培养时间6?12小时后加入甲醛杀菌；
将已杀菌的培养液离心收集上清。然后加入十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)至终浓度1.0g/L，充分搅拌后静置过夜，离心收集多糖。沉淀的多糖用氯化钙溶液搅拌3小时使多糖和CTAB解离。离心收集上清，上清加入乙醇至终浓度为25%(v/v)，2?8°C静置过夜，离心收集上清，上清加入乙醇至终浓度为75?80%(v/v)，充分振摇使多糖沉淀，静置18小时以上，离心收集沉淀，然后用无水乙醇和丙酮各洗三次，干燥后即为粗制多糖；
将粗糖溶解于10%饱和中性醋酸钠溶液中。然后按1: l(v/v)比例加入冷酚溶液，振荡混匀后离心收集上清液，抽提I?3次至上清液澄清。收集上清液，用超滤膜包超滤去除残余的苯酚及核酸。超滤后的多糖溶液中加入4mol/L NaCl溶液，至NaCl终浓度为0.3mol/L，然后加入95%乙醇至乙醇终浓度为75%(v/v)，充分混匀后2?8°C静置过夜，沉淀精糖。离心收集沉淀，然后依次用无水乙醇、丙酮各洗涤两次，干燥后即为精糖；
将精糖溶解于注射用水中。按多糖:溴化氰=1:0.5(w/w)的比例加入溴化氰溶液。维持温度23±3°C，pH10.8±0.2反应30分钟进行活化。活化完成后，按多糖:己二酰肼=1:3.5(w/w)的比例加入2.8%己二酰肼溶液。维持温度23 ± 3 °C，pH8.5 ± 0.2反应15分钟进行衍生。澄清过滤后，用0.05mol/L氯化钠溶液为超滤液，用超滤膜包超滤去除溴化氰，即为多糖衍生物。
[0020]按多糖:蛋白=1:0.8?1.2(w/w)的比例计算破伤风类毒素用量，加入多糖衍生物溶液中，按多糖:碳二亚胺=1: 10(w/w)的比例加入碳二亚胺，维持反应温度5 ±3°C ;pH5.7 土
0.2，反应60分钟，然后调节pH至6.9±0.1终止反应。经澄清过滤后，用0.15mol/L氯化钠溶液为超滤液，用超滤膜包超滤去除碳二亚胺。然后将多糖蛋白结合物溶液用Sepharose 4FF凝胶层析柱纯化。以0.15mol/L NaCl溶液为流动相，监测0D280nm的吸收值，收集Vo附近的洗脱峰。合并各次层析收获的洗脱液后即为纯化的结合物，经除菌过滤后，即为C群脑膜炎球菌结合疫苗原液；
513.制备b型流感嗜血杆菌结合疫苗原液
开启b型流感嗜血杆菌工作种子批菌种，接种至Hib综合培养基，温度35?37 °C，5?8%CO2环境中，培养16?24小时，然后经过三代扩增培养，制备数量适宜的生产用种子，接种至500L发酵罐培养，温度35?37°C，培养时间6?12小时后加入甲醛杀菌；
将已杀菌的培养液离心收集上清，然后加入十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)至终浓度I.0g/L，充分搅拌后静置过夜，离心收集多糖;沉淀的多糖用氯化钠溶液搅拌3小时使多糖和CTAB解离。离心收集上清，上清加入乙醇至终浓度为25%(v/v)，2?8°C静置过夜，离心收集上清，上清加入乙醇至终浓度为75?80%( v/v)，充分振摇使多糖沉淀，静置过夜，离心收集沉淀，用无水乙醇和丙酮各洗三次，干燥后即为粗制多糖；
将粗糖溶解于10%饱和中性醋酸钠溶液中，然后按1: l(v/v)比例加入冷酚溶液，振荡混匀后离心收集上清液，抽提I?3次至上清液澄清;收集上清液，用超滤膜包超滤去除残余的苯酚及核酸;超滤后的多糖溶液中加入4mol/L NaCl溶液，至NaCl终浓度为0.3mol/L，然后加入95%乙醇至乙醇终浓度为75%(v/v)，充分混匀后2?8°C静置过夜，沉淀精糖。离心收集沉淀，然后依次用无水乙醇、丙酮各洗涤两次，干燥后即为精糖。
[0021 ]将精糖溶解于注射用水中。按多糖:溴化氰=1:0.5(w/w)的比例加入溴化氰溶液。维持温度23 ± 3 °C，pH10.8 ± 0.2反应30分钟进行活化。活化完成后，按多糖:己二酰肼=1:3.5(w/w)的比例加入2.8%己二酰肼溶液。维持温度23 ± 3°C，pH8.5 ±0.2反应15分钟进行衍生。澄清过滤后，用0.05mol/L氯化钠溶液为超滤液，用超滤膜包超滤去除溴化氰，即为多糖衍生物。
[0022]按多糖:蛋白=1:0.8?1.2(w/w)的比例计算破伤风类毒素用量，加入多糖衍生物溶液中，按多糖:碳二亚胺=1: 10(w/w)的比例加入碳二亚胺，维持反应温度5 ±3°C ;pH5.7 土
0.2，反应60分钟，然后调节pH至6.9±0.1终止反应。经澄清过滤后，用0.15mol/L氯化钠溶液为超滤液，用超滤膜包超滤去除碳二亚胺。然后将多糖蛋白结合物溶液用Sepharose 4FF凝胶层析柱纯化。以0.15mol/L NaCl溶液为流动相，监测0D280nm的吸收值，收集VO附近的洗脱峰。合并各次层析收获的洗脱液后即为纯化的结合物，经除菌过滤后，即为b型流感嗜血杆菌结合疫苗原液；
52.制备联合疫苗:将制备的A群脑膜炎球菌结合疫苗原液、C群脑膜炎球菌结合疫苗原液、b型流感嗜血杆菌结合疫苗原液按重量比为1:1:1的比例混合均匀，混合液中加入乳糖，至结合多糖的含量为30yg/0.5mL;其中，A群脑膜炎球菌结合多糖为10yg/0.5mL、C群脑膜炎球菌结合多糖为10yg/0.5mL、b型流感嗜血杆菌结合多糖为10yg/0.5mL；
53.冻干:将冻干机的板层降温至_55°C，步骤S2制备的联合疫苗制品预冻4.5h，预冻后抽真空至0.0SmbaH呆持2.5h，采用三段升温(TC保持2.5h，温持续升温至35°C，制品温度达到30°C后打开真空控制维持温度保持25h，冻干结束后充氮气压盖出柜，即制得联合疫苗，其中，中所述三段升温的第一段温度为-30°C、第二段温度为-20°C、第三段温度为-20Γ。
[0023]实施例3:—种A群C群脑膜炎球菌b型流感嗜血杆菌联合疫苗的制备方法，它包括以下步骤:
S1.制备单价疫苗原液:包括制备A群脑膜炎球菌结合疫苗原液、制备C群脑膜炎球菌结合疫苗原液、制备b型流感嗜血杆菌结合疫苗原液；
Sll.制备A群脑膜炎球菌结合疫苗原液
开启A群脑膜炎球菌工作种子批菌种，接种至流脑半综合培养基，温度35?37°C，培养16?24小时，然后经过三代扩增培养，制备数量适宜的生产用种子，接种至500L发酵罐培养，温度35?37°C，培养时间6?12小时后加入甲醛杀菌；
将已杀菌的培养液离心收集上清，然后加入十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)至终浓度1.0g/L，充分搅拌后静置过夜，离心收集多糖。沉淀的多糖用氯化钙溶液搅拌3小时使多糖和CTAB解离，离心收集上清，上清加入乙醇至终浓度为25%( v/v)，2?8°C静置过夜，离心收集上清，上清加入乙醇至终浓度为75?80%(v/v)，充分振摇使多糖沉淀，静置18小时以上，离心收集沉淀，然后用无水乙醇和丙酮各洗三次，干燥后即为粗制多糖；
将粗糖溶解于10%饱和中性醋酸钠溶液中。然后按1: l(v/v)比例加入冷酚溶液，振荡混匀后离心收集上清液，抽提I?3次至上清液澄清，收集上清液，用超滤膜包超滤去除残余的苯酚及核酸，超滤后的多糖溶液中加入4mol/L NaCl溶液，至NaCl终浓度为0.3mol/L，然后加入95%乙醇至乙醇终浓度为75%(v/v)，充分混匀后2?8°C静置过夜，沉淀精糖，离心收集沉淀，然后依次用无水乙醇、丙酮各洗涤两次，干燥后即为精糖；
将精糖溶解于注射用水中，按多糖:溴化氰=1: 0.5(w/w)的比例加入溴化氰溶液，维持温度23±3°C，pH1.8±0.2反应30分钟进行活化，活化完成后，按多糖:己二酰肼=1:3.5(w/w)的比例加入2.8%己二酰肼溶液，维持温度23 ± 3 °C，pH8.5 ± 0.2反应15分钟进行衍生；澄清过滤后，用0.05mol/L氯化钠溶液为超滤液，用超滤膜包超滤去除溴化氰，即为多糖衍生物。；
按多糖:蛋白=1:0.8?1.2(w/w)的比例计算破伤风类毒素用量，加入多糖衍生物溶液中，按多糖:碳二亚胺=1:10(w/w)的比例加入碳二亚胺，维持反应温度5 ± 3°C ; pH5.7 ±0.2，反应60分钟，然后调节pH至6.9±0.1终止反应。经澄清过滤后，用0.15mol/L氯化钠溶液为超滤液，用超滤膜包超滤去除碳二亚胺。然后将多糖蛋白结合物溶液用Sepharose 4FF凝胶层析柱纯化。以0.15mol/L NaCl溶液为流动相，监测0D280nm的吸收值，收集Vo附近的洗脱峰。合并各次层析收获的洗脱液后即为纯化的结合物，经除菌过滤后，即为A群脑膜炎球菌结合疫苗原液；
S12.制备C群脑膜炎球菌结合疫苗原液
开启C群脑膜炎球菌工作种子批菌种，接种至流脑半综合培养基，温度35?37°C，培养16?24小时，然后经过三代扩增培养，制备数量适宜的生产用种子，接种至500L发酵罐培养，温度35?37°C，培养时间6?12小时后加入甲醛杀菌；
将已杀菌的培养液离心收集上清。然后加入十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)至终浓度
1.0g/L，充分搅拌后静置过夜，离心收集多糖。沉淀的多糖用氯化钙溶液搅拌3小时使多糖和CTAB解离。离心收集上清，上清加入乙醇至终浓度为25%(v/v)，2?8°C静置过夜，离心收集上清，上清加入乙醇至终浓度为75?80%(v/v)，充分振摇使多糖沉淀，静置18小时以上，离心收集沉淀，然后用无水乙醇和丙酮各洗三次，干燥后即为粗制多糖；
将粗糖溶解于10%饱和中性醋酸钠溶液中。然后按1: l(v/v)比例加入冷酚溶液，振荡混匀后离心收集上清液，抽提I?3次至上清液澄清。收集上清液，用超滤膜包超滤去除残余的苯酚及核酸。超滤后的多糖溶液中加入4mol/L NaCl溶液，至NaCl终浓度为0.3mol/L，然后加入95%乙醇至乙醇终浓度为75%(v/v)，充分混匀后2?8°C静置过夜，沉淀精糖。离心收集沉淀，然后依次用无水乙醇、丙酮各洗涤两次，干燥后即为精糖；
将精糖溶解于注射用水中。按多糖:溴化氰=1:0.5(w/w)的比例加入溴化氰溶液。维持温度23±3°C，pH10.8±0.2反应30分钟进行活化。活化完成后，按多糖:己二酰肼=1:3.5(w/w)的比例加入2.8%己二酰肼溶液。维持温度23 ± 3 °C，pH8.5 ± 0.2反应15分钟进行衍生。澄清过滤后，用0.05mol/L氯化钠溶液为超滤液，用超滤膜包超滤去除溴化氰，即为多糖衍生物。
[0024]按多糖:蛋白=1:0.8?1.2(w/w)的比例计算破伤风类毒素用量，加入多糖衍生物溶液中，按多糖:碳二亚胺=1: 10(w/w)的比例加入碳二亚胺，维持反应温度5 ±3°C ;pH5.7 土
0.2，反应60分钟，然后调节pH至6.9±0.1终止反应。经澄清过滤后，用0.15mol/L氯化钠溶液为超滤液，用超滤膜包超滤去除碳二亚胺。然后将多糖蛋白结合物溶液用Sepharose 4FF凝胶层析柱纯化。以0.15mol/L NaCl溶液为流动相，监测0D280nm的吸收值，收集Vo附近的洗脱峰。合并各次层析收获的洗脱液后即为纯化的结合物，经除菌过滤后，即为C群脑膜炎球菌结合疫苗原液；
S13.制备b型流感嗜血杆菌结合疫苗原液
开启b型流感嗜血杆菌工作种子批菌种，接种至Hib综合培养基，温度35?37 °C，5?8%CO2环境中，培养16?24小时，然后经过三代扩增培养，制备数量适宜的生产用种子，接种至500L发酵罐培养，温度35?37°C，培养时间6?12小时后加入甲醛杀菌；
将已杀菌的培养液离心收集上清，然后加入十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)至终浓度I.0g/L，充分搅拌后静置过夜，离心收集多糖;沉淀的多糖用氯化钠溶液搅拌3小时使多糖和CTAB解离。离心收集上清，上清加入乙醇至终浓度为25%(v/v)，2?8°C静置过夜，离心收集上清，上清加入乙醇至终浓度为75?80%( v/v)，充分振摇使多糖沉淀，静置过夜，离心收集沉淀，用无水乙醇和丙酮各洗三次，干燥后即为粗制多糖；
将粗糖溶解于10%饱和中性醋酸钠溶液中，然后按1: l(v/v)比例加入冷酚溶液，振荡混匀后离心收集上清液，抽提I?3次至上清液澄清;收集上清液，用超滤膜包超滤去除残余的苯酚及核酸;超滤后的多糖溶液中加入4mol/L NaCl溶液，至NaCl终浓度为0.3mol/L，然后加入95%乙醇至乙醇终浓度为75%(v/v)，充分混匀后2?8°C静置过夜，沉淀精糖。离心收集沉淀，然后依次用无水乙醇、丙酮各洗涤两次，干燥后即为精糖。
[0025]将精糖溶解于注射用水中。按多糖:溴化氰=1:0.5(w/w)的比例加入溴化氰溶液。维持温度23 ± 3 °C，pH10.8 ± 0.2反应30分钟进行活化。活化完成后，按多糖:己二酰肼=1:3.5(w/w)的比例加入2.8%己二酰肼溶液。维持温度23 ± 3°C，pH8.5 ±0.2反应15分钟进行衍生。澄清过滤后，用0.05mol/L氯化钠溶液为超滤液，用超滤膜包超滤去除溴化氰，即为多糖衍生物。
[0026]按多糖:蛋白=1:0.8?1.2(w/w)的比例计算破伤风类毒素用量，加入多糖衍生物溶液中，按多糖:碳二亚胺=1: 10(w/w)的比例加入碳二亚胺，维持反应温度5 ±3°C ;pH5.7 土
0.2，反应60分钟，然后调节pH至6.9±0.1终止反应。经澄清过滤后，用0.15mol/L氯化钠溶液为超滤液，用超滤膜包超滤去除碳二亚胺。然后将多糖蛋白结合物溶液用Sepharose 4FF凝胶层析柱纯化。以0.15mol/L NaCl溶液为流动相，监测0D280nm的吸收值，收集VO附近的洗脱峰。合并各次层析收获的洗脱液后即为纯化的结合物，经除菌过滤后，即为b型流感嗜血杆菌结合疫苗原液；
52.制备联合疫苗:将制备的A群脑膜炎球菌结合疫苗原液、C群脑膜炎球菌结合疫苗原液、b型流感嗜血杆菌结合疫苗原液按重量比为1:1:1的比例混合均匀，混合液中加入乳糖，至结合多糖的含量为30yg/0.5mL;其中，A群脑膜炎球菌结合多糖为10yg/0.5mL、C群脑膜炎球菌结合多糖为10yg/0.5mL、b型流感嗜血杆菌结合多糖为10yg/0.5mL；
53.冻干:将冻干机的板层降温至_50°C，步骤S2制备的联合疫苗制品预冻4h，预冻后抽真空至0.06mbaH呆持2h，采用三段升温(TC保持2h，温持续升温至32°C，制品温度达到29°(:后打开真空控制维持温度保持20h，冻干结束后充氮气压盖出柜，即制得联合疫苗，其中，中所述三段升温的第一段温度为_42°C、第二段温度为_25°C、第三段温度为-10°C。
【主权项】
1.一种A群C群脑膜炎球菌b型流感嗜血杆菌联合疫苗的制备方法，其特征在于，它包括以下步骤: 51.制备单价疫苗原液:包括制备A群脑膜炎球菌结合疫苗原液、制备C群脑膜炎球菌结合疫苗原液、制备b型流感嗜血杆菌结合疫苗原液； 52.制备联合疫苗:将制备的A群脑膜炎球菌结合疫苗原液、C群脑膜炎球菌结合疫苗原液、b型流感嗜血杆菌结合疫苗原液按重量比为1:1:1的比例混合均匀，混合液中加入乳糖，至结合多糖的含量为30yg/0.5mL; 53.冻干:将冻干机的板层降温至-45?-55°C，步骤S2制备的联合疫苗制品预冻3.5?4.5h，预冻后抽真空至0.05?0.08mbar保持1.5?2.5h，采用三段升温O°C保持1.5?2.5h， 温持续升温至28?35°C，制品温度达到28?30°C后打开真空控制维持温度保持15?25h，冻干结束后充氮气压盖出柜，即制得联合疫苗。2.如权利要求1所述的一种A群C群脑膜炎球菌b型流感嗜血杆菌联合疫苗的制备方法，其特征在于，步骤S2中A群脑膜炎球菌结合多糖为10yg/0.5mL、C群脑膜炎球菌结合多糖为10yg/0.5mL、b型流感嗜血杆菌结合多糖为10yg/0.5mL。3.如权利要求1所述的一种A群C群脑膜炎球菌b型流感嗜血杆菌联合疫苗的制备方法，其特征在于，步骤S3中所述三段升温的第一段温度为-50?-30°C、第二段温度为-30?-200C、第三段温度为-20?O °C。
【文档编号】A61P31/04GK106075421SQ201610622999
【公开日】2016年11月9日
【申请日】2016年8月2日 公开号201610622999.2, CN 106075421 A, CN 106075421A, CN 201610622999, CN-A-106075421, CN106075421 A, CN106075421A, CN201610622999, CN201610622999.2
【发明人】吴强, 陈道远, 李晟, 陈元芬
【申请人】成都欧林生物科技股份有限公司