一种提高精氨酸产量的工程菌、生物材料及其应用的制作方法

本发明涉及分子生物学，具体涉及一种提高精氨酸产量的工程菌、生物材料及其应用。

背景技术：

1、l-精氨酸是生物体内的一种半必需碱性氨基酸，人体虽能够合成精氨酸，但通常不能满足正常的需要，是尿素循环途径中重要代谢产物之一，可把高浓度的氨转换为尿素随尿液排出，从而有效解除血氨中毒。l-精氨酸是一氧化氮的自然前体物质，在一氧化氮信号途径中通过一氧化氮合酶(nitric oxide synthase，nos)的催化生成一氧化氮和瓜氨酸，从而具有松弛血管平滑肌的功能。l-精氨酸在营养免疫，抗肿瘤，治疗炎症以及伤口愈合方面都具有良好的疗效，可用来制作氨基酸药物，如氨基酸注射液、氨基酸口服液、氨基酸制剂等。此外，由于l-精氨酸具有耐缺氧，抗疲劳等功效，可用于制造功能性食品，提高运动员，部队士兵的整体素质。还可以应用于食品补充剂、临床营养制剂等。目前精氨酸生产菌株的升级主要通过合成途径强化、代谢网络的改造(分支途径的改造，阻断脯氨酸、赖氨酸、谷氨酰胺的合成，减少代谢流的损失；辅助因子优化，强化ppp途径)以及促进精氨酸的胞外运输等方面来进行。随着合成生物学手段的不断发展，越来越多的代谢工程策略应用于构建精氨酸高效生产的细胞工厂。然而，关注于代谢途径的理性改造虽然目的明确，效果显著，但由于微生物是一个复杂的系统，已知的代谢网络或改造思路并不能进一步达到快速提高产量的目的。

技术实现思路

1、为了解决上述问题，本发明通过对菌株的耐受性筛选获得了一株能够耐受高浓度精氨酸的菌株，在对菌株的基因组测序并对蛋白序列进行分析后，发现该菌株中的一些蛋白发生了点突变，并且这些突变体能够提高精氨酸的产量。本发明通过诱发菌株产生与目标氨基酸合成的主要代谢途径以及糖酵解途径不相关的突变，获得了具有优良性质的菌株。然而，由于生物体的代谢网络具有高度的复杂性，本发明所获得的突变结果存在较高的不确定性，且难以在研究初期进行准确的预测与调控。本领域技术人员通常不会想到这些蛋白的改造是否对精氨酸的生产有利。

2、本发明一方面保护一种提高精氨酸产量的工程菌，其经过对出发菌的fade、pepn、mngr表达盒进行直接改造，或将改造后的fade、pepn、mngr表达盒导入所述出发菌，获得精氨酸产量提高的工程菌；所述改造为任何能够强化fade和/或pepn蛋白功能应用的方法及其组合和/或任何能够弱化mngr蛋白表达水平的方法及其组合。

3、对于上文所述的技术方案，进一步优选的，所述的改造方式选自下述至少一种技术手段：

4、a在所述出发菌中，对所述fade和/或pepn蛋白进行的改造为如下任一：

5、(a1)对fade蛋白进行两个氨基酸位点的突变，分别是a140t，l171i，获得突变蛋白fadea140t，l171i，其氨基酸序列如seq id no.1所示；

6、(a2)对pepn蛋白进行三个氨基酸位点的突变，分别是q4n，d419e，v509a，获得突变蛋白pepnq4n，d419e，v509a，其氨基酸序列如seq id no.2所示；

7、(a3)以高拷贝质粒为载体，对fade蛋白、pepn蛋白、fadea140t，l171i突变蛋白和/或pepnq4n，d419e，v509a突变蛋白的编码基因进行过表达；

8、(a4)将基因组中fade蛋白、pepn蛋白、fadea140t，l171i突变蛋白和/或pepnq4n，d419e，v509a突变蛋白编码基因的启动子替换为强启动子；

9、(a5)提高fade蛋白、pepn蛋白、fadea140t，l171i突变蛋白和/或pepnq4n，d419e，v509a突变蛋白编码基因转录的mrna的稳定性；

10、b在所述出发菌中，对所述mngr蛋白进行的改造为如下任一：

11、(b1)敲除出发菌中mngr蛋白的编码基因；

12、(b2)对mngr蛋白进行两个氨基酸位点的突变，分别对应q49n和r131k，获得mngr的突变蛋白mngrq49n，r131k，其氨基酸序列如seq id no.3所示；

13、(b3)在基因组上将mngr蛋白或mngrq49n，r131k突变蛋白编码基因的启动子替换为弱启动子；

14、(b4)抑制mngr蛋白或mngrq49n，r131k突变蛋白编码基因转录得到的mrna的翻译效率或降低其稳定性。

15、对于上文所述的技术方案，进一步优选的，所述的出发菌选自大肠杆菌，谷氨酸棒杆菌，枯草芽孢杆菌，酵母细胞中任意一种。

16、对于上文所述的技术方案，进一步优选的，所述的出发菌选自菌株突变菌株iberq，突变菌株iberq-115，大肠埃希菌nissle1917，大肠杆菌bl21，大肠杆菌hb101，大肠杆菌jm109，大肠杆菌dh10b或大肠杆菌mg1655中的一种。

17、对于上文所述的技术方案，进一步优选的，所述的出发菌选自菌株谷氨酸棒杆菌atcc13002、谷氨酸棒杆菌atcc14067、乳酸发酵短杆菌(brevibacterium lactofermentum)atcc 21798、乳酸发酵短杆菌atcc 21799、乳酸发酵短杆菌atcc 21800、乳酸发酵短杆菌atcc21801、乳酸发酵短杆菌atcc 21086、黄色短杆菌atcc 21475、黄色短杆菌atcc 21127、黄色短杆菌atcc 21128、黄色短杆菌atcc 21129、黄色短杆菌atcc 21474、黄色短杆菌atcc21493、黄色短杆菌atcc 21406、黄色短杆菌atcc 21605、产氨短杆菌(brevibacteriumammoniagones)atcc 19355、嗜乙酰乙酸棒杆菌(corynebacterium acetoacidophilum)atcc 21476、嗜乙酰乙酸棒杆菌atcc 21407、谷氨酸棒杆菌atcc 21831、谷氨酸棒杆菌atcc13286、谷氨酸棒杆菌atcc 21659、谷氨酸棒杆菌atcc 21339、醋谷棒杆菌(corynebacterium acctoglutamicum)atcc21491及它们的混合物中的一种。

18、本发明的另一方面在于保护一种生物材料，其选自下述中的至少一种：

19、(i)蛋白：fadea140t，l171i、pepnq4n，d419e，v509a和/或mngrq49n，r131k突变体蛋白；

20、(ii)基因：fadea140t，l171i、pepnq4n，d419e，v509a和/或mngrq49n，r131k突变体蛋白的编码基因；

21、(iii)表达盒：含有所述fadea140t，l171i、pepnq4n，d419e，v509a和/或mngrq49n，r131k突变体蛋白的编码基因的表达盒或者含有所述dna片段的表达盒；

22、(iv)重组载体：含有所述fadea140t，l171i、pepnq4n，d419e，v509a和/或mngrq49n，r131k突变体蛋白的编码基因的重组载体或含有所述dna片段的重组载体；

23、(v)重组菌：含有所述fadea140t，l171i、pepnq4n，d419e，v509a和/或mngrq49n，r131k突变体蛋白的编码基因的重组菌或含有所述dna片段的重组菌；

24、(vi)利用上述方法获得的工程菌。

25、本发明的另一方面在于保护上述生物材料的应用，其选自下述中的至少一种：

26、(a)上文所述的生物材料在提高出发菌精氨酸产量中的应用；

27、(b)上文所述的生物材料在生产精氨酸中的应用；

28、(c)fadea140t，l171i、pepnq4n，d419e，v509a和/或mngrq49n，r131k突变体蛋白在提高出发菌精氨酸产量中的应用；

29、(d)fadea140t，l171i、pepnq4n，d419e，v509a和/或mngrq49n，r131k突变体蛋白在生产精氨酸中的应用。

30、对于上文所述的技术方案，进一步优选的，所述生物材料fadea140t，l171i突变体蛋白具体为如下任一所示蛋白质：

31、(a1)氨基酸序列为seq id no.1的蛋白质；

32、(a2)将seq id no.1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；

33、(a3)与(a1)-(a2)中任一所限定的氨基酸序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性且具有相同功能的蛋白质；

34、(a4)在(a1)-(a3)中任一所限定的蛋白质的n端和/或c端连接标签后得到的融合蛋白；

35、或，所述生物材料pepnq4n，d419e，v509a突变体蛋白具体为如下任一所示蛋白质：

36、(a1)氨基酸序列为seq id no.2的蛋白质；

37、(a2)将seq id no.2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；

38、(a3)与(a1)-(a2)中任一所限定的氨基酸序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性且具有相同功能的蛋白质；

39、(a4)在(a1)-(a3)中任一所限定的蛋白质的n端和/或c端连接标签后得到的融合蛋白；

40、或，所述生物材料mngrq49n，r131k突变体蛋白具体为如下任一所示蛋白质：

41、(a1)氨基酸序列为seq id no.3的蛋白质；

42、(a2)将seq id no.3所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；

43、(a3)与(a1)-(a2)中任一所限定的氨基酸序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性且具有相同功能的蛋白质；

44、(a4)在(a1)-(a3)中任一所限定的蛋白质的n端和/或c端连接标签后得到的融合蛋白。

45、对于上文所述的技术方案，进一步优选的，对应于基因水平，所述fadea140t，l171i、突变体蛋白的编码基因具体为与fadea140t，l171i突变体蛋白的编码基因限定的dna序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性且编码所述fadea140t，l171i突变体蛋白的dna分子；

46、或，对应于基因水平，所述pepnq4n，d419e，v509a突变体蛋白的编码基因具体为与pepnq4n，d419e，v509a突变体蛋白的编码基因限定的dna序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性且编码所述pepnq4n，d419e，v509a突变体蛋白的dna分子；

47、或，对应于基因水平，所述mngrq49n，r131k突变体蛋白的编码基因具体为与mngrq49n，r131k突变体蛋白的编码基因限定的dna序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性且编码所述mngrq49n，r131k突变体蛋白的dna分子。

48、在本发明中，所述生产精氨酸具体为当菌株在培养中被培养时能够产生精氨酸并且能够积累精氨酸。

49、本文所用的术语“本发明的蛋白”具有本领域普通技术人员通常理解的含义。

50、本发明的“fade蛋白突变体”是通过针对seq id no.4所示氨基酸序列进行突变获得的。具体地，本发明的fade蛋白突变体是在对应于seq id no.4所示氨基酸序列的第140位和第171位分别被苏氨酸和异亮氨酸所替代。此外，本发明的范围还包括与seq id no.1具有大于80％，优选90％，更优选95％，最优选99％以上同源性的、具有与“fade蛋白突变体”功能相同的蛋白质。

51、本发明的“pepn蛋白突变体”是通过针对seq id no.5所示氨基酸序列进行突变获得的。具体地，本发明的pepn蛋白突变体是在对应于seq id no.5所示氨基酸序列的第4位、第419位和第509位分别被天冬酰胺、谷氨酸和丙氨酸所替代。此外，本发明的范围还包括与seq id no.2具有大于80％，优选90％，更优选95％，最优选99％以上同源性的、具有与“pepn蛋白突变体”功能相同的蛋白质。

52、同样地，本发明的“mngr蛋白突变体”是通过针对seq id no.6所示氨基酸序列进行突变获得的。具体地，本发明的mngr蛋白突变体是在对应于seq id no.6所示氨基酸序列的第49位和第131位分别被天冬酰胺和赖氨酸所替代。此外，本发明的范围还包括与seq idno.3具有大于80％，优选90％，更优选95％，最优选99％以上同源性的、具有与“mngr蛋白突变体”功能相同的蛋白质。

53、本文所用的术语“外源性”是指某体系中包含了原来不存在的物质。例如，包括但不限于通过转化等方式在某菌株中引入该菌株中原本不存在的酶的编码基因，从而在该菌株中表达该酶，则该酶对于该菌株是“外源性”的。

54、本文所用的术语“强化”不仅包括由于蛋白质自身活性的增加而带来的比原始功能更高的效果，而且其可以通过选自如下的至少一种方法进行：增加编码蛋白质的核苷酸的拷贝数、对编码蛋白质的基因的调控序列进行修饰、用具有强活性的序列置换染色体上编码蛋白质的基因的调控序列、用突变基因置换编码蛋白质的基因以增加蛋白质的活性、在染色体上编码蛋白质的基因中引入修饰以增强蛋白质的活性，也可以非限制性地包括任何可行的方法，只要与内源性活性相比能够增强蛋白质的活性或增强引入蛋白质的活性。

55、本文所用的术语“引入蛋白质的活性”具有本领域技术人员常规理解的含义，并且可以通过本领域已知的方法实施，包括但不限于，如：将包含编码蛋白质的多核苷酸序列的多核苷酸插入到染色体上，和/或将多核苷酸克隆到载体上引入微生物，和/或在染色体上行直接增加该多核苷酸的拷贝数，和/或改造具有编码蛋白质的多核苷酸启动子以增强转录启动速度，和/或对编码蛋白质的多核苷酸的转录进行修饰以增强其活性，和/或修改携带有所述编码蛋白质的多核苷酸的信使rna的翻译调控序列以增强翻译强度，和/或修改编码蛋白质的多核苷酸本身以增强mrna稳定性、蛋白质稳定性、解除蛋白质的反馈抑制等方法来实现，也可以非限制性地包括任何已知的可以引入蛋白质活性的方法。

56、载体是包括编码靶蛋白的多核苷酸序列的dna构建体，其被可操作地链接至合适的调控序列以使靶蛋白可在宿主细胞中表达。载体在被转入合适的宿主细胞后可独立于宿主细胞基因组复制或起作用，或可以被整合到宿主的基因组上。这些载体可以不特别地限制，只要该载体在宿主细胞中是可复制的。载体的实例包括天然或重组质粒、粘粒、病毒和噬菌体。例如，pwe15、pet、puc载体等。另外，通过将载体插入到宿主细胞的染色体上，可以将染色体上编码内源靶蛋白的多核苷酸替换成为修饰的多核苷酸。将多核苷酸插入染色体可以使用本领域已知的任何方法进行，包括但不限于，如：通过同源重组。多核苷酸包括编码的靶蛋白的dna和rna，其可以以任何形式插入到宿主细胞的染色体上，只要其能够在宿主细胞中表达。包括但不限于，如：多核苷酸可以以原始状态、和/或表达盒的形式引入宿主细胞。表达盒是包括自我表达所需的所有必需元件的基因构建体，也可以是能够自我复制的表达载体，可以包括可操作地结合至多核苷酸的启动子、转录终止信号、核糖体结合结构域和翻译终止信号。

57、类似地，本文所用的术语“弱化”是指降低、削弱、减小或完全消除某种蛋白，例如酶的活性。在具体的实施方式中，减弱酶的活性可以通过部分或全部敲除酶的编码基因、基因突变失活或部分失活、基因启动子或翻译调控区改变令其转录或翻译弱化、改变基因序列使其mrna稳定性减弱或酶结构不稳定、通过srna对基因进行调控等方法或其组合来实现，包括但不限于以上方法。

58、本文所用的术语“宿主细胞”是具有本领域普通技术人员通常理解的含义，即含有蛋白或其蛋白突变体的菌株。换言之，本发明可以利用任何宿主细胞，只要所述细胞中含有目标蛋白或其突变体且能够生产精氨酸的细胞。所述宿主细胞可以来自优选大肠杆菌(e.coli)或谷氨酸棒杆菌。具体地，本发明所述的宿主是指能够生产精氨酸的菌株，即，当细菌在培养中被培养时能够产生精氨酸并且能够积累精氨酸，或者能够将精氨酸分泌到培养基中，也就是能够得到胞外的游离精氨酸，特别是指与野生型菌株或者亲本菌株相比，能够积累更多精氨酸的能力。为了赋予菌株产精氨酸的能力，可以采用传统的育种方法，比如培育营养缺陷型的突变株、抗类似物的菌株，或者能够产精氨酸的代谢控制突变株，以及培育氨基酸生物合成相关酶活性提高的重组菌株的方法，或者以上方法的组合。

59、本文所用的术语“含有本发明的fade、pepn、mngr蛋白突变体”具有本领域技术人员常规理解的含义，并且可以通过本领域已知的方法实施，包括但不限于，如：将包含编码蛋白的多核苷酸序列的多核苷酸插入到染色体上，和/或将多核苷酸克隆到载体上引入微生物，和/或在染色体上行直接增加该多核苷酸的拷贝等方法来实现，也可以非限制性地包括任何已知的可以引入蛋白活性的方法。

60、本领域技术人员知晓，为提升活性而对野生型多肽进行突变，找到能实现所需目的的位点更为重要。因此，基于本发明的教导，本领域技术人员会对fade蛋白所示氨基酸序列的第140位丙氨酸被苏氨酸替代，第171位亮氨酸被异亮氨酸替代。对pepn蛋白所示氨基酸序列的第4位谷氨酰胺被天冬酰胺替代，第419位天冬氨酸被谷氨酸替代，第509位的缬氨酸被丙氨酸所替代、mngr蛋白所示氨基酸序列的第49位谷氨酰胺被天冬酰胺替代，第131位精氨酸被赖氨酸替代，并检测突变体的相关活性。

61、此外，本领域普通技术人员也不难知晓，在多肽的某些区域，例如非重要区域改变少数氨基酸残基基本上不会改变生物活性，例如，适当替换某些氨基酸得到的序列并不会影响其活性(可参见watson等，molecular biology of the gene，第四版，1987，thebenjamin/cummings pub.co.p224)。因此，本领域普通技术人员能够实施这种替换并且确保所得分子仍具有所需生物活性。

62、因此，对本发明的fade、pepn、mngr蛋白及其突变体作进一步突变而得到仍具备相应功能和活性的进一步突变体是显而易见的。例如，本领域技术人员公知在多肽的任一端增加或减少数个氨基酸残基，例如优选1-20个、更优选1-15个、更优选1-10个、更优选1-3个、最优选1个氨基酸残基不会影响得到的突变体的功能。例如，为便于纯化，技术人员往往在得到的蛋白的任一端带上6×his标签，而这种蛋白与不具备6×his标签的蛋白具有相同的功能。因此，本发明应包括在本发明基础上得到的保守性突变体。

63、与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

64、本发明在出发菌中，对mngr基因表达的蛋白序列或fade、pepn基因表达的蛋白序列进行改造，获得与所述出发菌相比精氨酸产量提高的工程菌；所述出发菌为精氨酸生产菌株；所述对mngr基因进行的改造为降低其表达水平或蛋白活性，甚至敲除；所述对fade、pepn基因进行的改造为对其进行突变，以及提高其表达水平或蛋白活性。在规模化生产的情况下，5l发酵罐中精氨酸产量达到113.9±5.80g/l，糖酸转化率50.14％％。相比原始菌，精氨酸的产量提升了1.29倍倍；糖酸转化率提高了1.13倍。