一种狂犬病病毒检测的序列组合及捕获方法与流程

本发明涉及病毒检测领域，具体涉及一种狂犬病病毒检测的序列组合及捕获方法。

背景技术：

1、狂犬病是由狂犬病病毒感染引起的一种动物源性传染病，临床大多表现为特异性恐风、恐水、咽肌痉挛、进行性瘫痪等，一旦发病死亡率接近100％，是我国法定报告传染病。全球有33亿多人居住在狂犬病地方性流行区，每年大约有5.5万人死于狂犬病。狂犬病是一种疫苗可预防的疾病，一般规范接种狂犬免疫球蛋白和疫苗，保护率接近100％。狂犬病病毒属于单负病毒目弹状病毒科狂犬病毒属。狂犬病病毒颗粒呈子弹状，长100-300nm，直径约75nm。病毒基因组长约12kb，为不分节段的单股负链rna。狂犬病病毒属于rna病毒，具有容易变异的特征。因此，持续性监测病毒基因的变化，对狂犬病的防控和评价疫苗的保护效力至关重要，开发相应的快速鉴定试剂具有重大的社会和经济意义。

2、现有技术对狂犬病病毒的检测通常采用荧光定量pcr方法或者宏基因组测序。其中，荧光定量pcr方法虽然能快速有效的检测狂犬病病毒，但该类试剂盒是根据已知病毒序列设计特异性引物和探针，因此只能鉴别已知病毒类型，不能鉴定未知新型病毒；此外，由于病毒基因序列变异，会导致引物和探针扩增失败，检测敏感性降低，因此需要定期更换引物和探针，并重新进行实际评估；再者，荧光定量pcr针对病毒部分基因设计，不能扩增全基因组序列，因而不能对病毒的进化和变异进行分析。

3、而宏基因组测序在具体应用中存在操作复杂、检测时间相对较长(需要24-72小时)并且不容易拿到全基因组信息，对数据量要求高等诸多问题。因此，病原宏基因组测序(mngs)在狂犬病病毒的检测上无法实现大范围推广、快速诊断的目的。

4、现有技术中还有采用病毒分离的方法，但是对于病毒分离虽然可提高病毒基因检测的敏感性，但按照《人间传染的病原微生物目录》，分离狂犬病病毒街毒需要在高等级实验室(p3实验)开展。目前，拥有p3实验室的机构很少，特别是在基层单位根本没有，因此对通过病毒分离来研究和分析狂犬病病毒带来很大的局限性。

技术实现思路

1、针对现有技术的上述不足，本发明提供了一种快速、方便、经济的狂犬病病毒检测的序列组合。

2、为达到上述发明目的，本发明所采用的技术方案为：

3、提供一种狂犬病病毒检测的序列组合，其包括对狂犬病病毒基因组全序列设计的91条叠瓦式pcr扩增引物，91条叠瓦式扩增引物序列依次为seq idno.1-91。

4、一种试剂盒，其包含狂犬病病毒检测的序列组合，序列组合包括针对狂犬病病毒基因组全序列设计的91条叠瓦式pcr扩增引物，91条叠瓦式扩增引物序列依次为seq idno.1-91。

5、一种狂犬病病毒检测的测序片段捕获方法，包括如下具体步骤：

6、s1：rna提取：将标本中的狂犬病病毒进行rna提取；

7、s2：引物设计与pcr扩增：使用针对狂犬病病毒保守区域设计的91条叠瓦式扩增引物，引物序列依次为seq id no.1-91，应用rt-pcr扩增体系，取步骤s1提取的狂犬病病毒rna，进行快速扩增；

8、s3：测序：扩增反应结束后，将pcr反应中得到大小不同的狂犬病病毒基因片段，建库并上机进行测序。

9、进一步的，步骤s1中的标本为唾液标本或脑组织标本。

10、进一步的，所述步骤s2包括如下步骤：

11、s201：将狂犬病病毒rna进行逆转录得到逆转录产物；

12、s202：将逆转录产物平均分为两份，分别使用第一rt-pcr扩增体系和第二rt-pcr扩增体系进行扩增；所述第一rt-pcr扩增体系中使用91条叠瓦式扩增引物名称中包含奇数的引物组，所述第二rt-pcr扩增体系中使用91条叠瓦式扩增引物中引物名称中包含偶数的引物组；

13、s203：将第一rt-pcr扩增体系的扩增产物和第二rt-pcr扩增体系的扩增产物混合后进入步骤s3。

14、进一步的，所述步骤s201中逆转录体系包括狂犬病病毒rna和逆转录酶，且狂犬病病毒rna与逆转录酶的比例为16∶4；

15、且逆转录体系的pcr扩增程序包括：

16、第一阶段包括：25℃下持续10min；第二阶段包括：50℃下持续10min；第三阶段包括：85℃下持续5min；第四阶段包括：降温至4℃保存。

17、进一步的，第一rt-pcr扩增体系包括热启动高保真dna聚合酶、91条叠瓦式扩增引物名称中包含奇数的引物组、无核酶水和逆转录产物，其比例为12.5∶1.8∶5.7∶5；

18、第二rt-pcr扩增体系包括热启动高保真dna聚合酶、91条叠瓦式扩增引物中引物名称中包含偶数的引物组、无核酶水和逆转录体系，其比例为12.5∶1.8∶5.7∶5；

19、第一rt-pcr扩增体系和第二rt-pcr扩增体系均采用如下pcr扩增程序：

20、第一阶段包括：98℃下持续30s；第二阶段包括：98℃下持续10s；第三阶段包括：65℃下持续5min；第二和第三阶段执行30个循环后进入第四阶段；第四阶段包括：降温至4℃保存。

21、序列组合在制备检测狂犬病病毒试剂盒中的用途。

22、本发明的有益效果为：

23、本发明通过狂犬病病毒基因组全序列设计多对叠瓦式pcr扩增引物，加上高效逆转录体系和高保真dna聚合酶扩增体系，仅需少量rna便可方便快速的扩增出狂犬病病毒全基因组，可对接二代测序建库试剂和三代测序平台，可快速方便地获得狂犬病病毒全基因组序列，实现狂犬病病毒的检测。

技术特征：

1.一种狂犬病病毒检测的序列组合，其特征在于，包括针对狂犬病病毒基因组全序列设计的91条叠瓦式pcr扩增引物，所述91条叠瓦式扩增引物序列依次为seq id no.1-91。

2.一种试剂盒，其包含狂犬病病毒检测的序列组合，其特征在于，所述序列组合包括针对狂犬病病毒基因组全序列设计的91条叠瓦式pcr扩增引物，所述91条叠瓦式扩增引物序列依次为seq id no.1-91。

3.一种狂犬病病毒检测的测序片段捕获方法，其特征在于，包括如下具体步骤：

4.根据权利要求3所述的测序片段捕获方法，其特征在于，所述步骤s1中的标本为唾液标本或脑组织标本。

5.根据权利要求3所述的测序片段捕获方法，其特征在于，所述步骤s2包括如下步骤：

6.根据权利要求5所述的测序片段捕获方法，其特征在于，所述步骤s201中逆转录体系包括狂犬病病毒rna和逆转录酶，且狂犬病病毒rna与逆转录酶的比例为16∶4；

7.根据权利要求5所述的测序片段捕获方法，其特征在于，第一rt-pcr扩增体系包括热启动高保真dna聚合酶、91条叠瓦式扩增引物名称中包含奇数的引物组、无核酶水和逆转录产物，其比例为12.5∶1.8∶5.7∶5；

8.权利要求1所述的序列组合在制备检测狂犬病病毒试剂盒中的用途。

技术总结
本发明公开了一种狂犬病病毒检测的序列组合及捕获方法，涉及病毒检测领域，包括针对狂犬病病毒基因组全序列设计的91条叠瓦式PCR扩增引物，91条叠瓦式扩增引物序列依次为SEQ ID No.1‑91。本发明通过狂犬病病毒基因组全序列设计多对叠瓦式PCR扩增引物，加上高效逆转录体系和高保真DNA聚合酶扩增体系，仅需少量RNA便可方便快速的扩增出狂犬病病毒全基因组，可对接二代测序建库试剂和三代测序平台，可快速方便地获得狂犬病病毒全基因组序列，实现狂犬病病毒的检测。

技术研发人员：冯玉亮,李伟,蒋明凤,钟红荣,潘明
受保护的技术使用者：四川省疾病预防控制中心
技术研发日：
技术公布日：2024/3/27