一种基于体外全酶法的鹅肌肽制备方法与流程

本发明涉及生物合成，特别涉及一种基于体外全酶法的鹅肌肽制备方法。

背景技术：

1、鹅肌肽（β-丙氨酰-1-甲基 l-组氨酸，anserine）为高度稳定的水溶性二肽，为从天然原料中分离得到的第一个具有代表性的生物活性肽。鹅肌肽具有显著的抗氧化、降尿酸等功能，在食品工业和医药工业已被广泛使用。目前鹅肌肽有两种主流生产方法，第一种方法是直接从动物源原材料中进行提取获得；另一种方法是通过化学合成法进行制备。直接提取法所需的原料主要是深海鱼类的鱼肉，比如金枪鱼。专利cn202011443114.5中给出的操作流程如下：将鱼肉捣碎后于沸水中进行过筛过滤，收集滤液后用超滤膜进行超滤处理，然后浓缩即可获得鹅肌肽产品。该方法要用到超滤膜，价格昂贵，推高了整体成本，经济实用性并不很好。

2、相比于直接提取法，化学合成法操作较为复杂，最近相关化学合成法专利cn201910947896.7的主要思路是在反应体系中加氯甲酸酯类化合物或戊酰氯形成混酐，混酐再进行缩合得到鹅肌肽中间体。上述反应底物为l-组氨酸和β-丙氨酸，然后鹅肌肽中间体在还原剂和钯类金属催化剂的反应体系中发生反应，最终获得鹅肌肽。

3、最早期的化学合成法是rinderknecht报道的，该报道采用甲基组氨酸与丙氨酸进行反应，先进行缩合后肼解，加入硝酸成盐后获得鹅肌肽硝酸盐，再用离子交换树脂交换后得到鹅肌肽。该该路线收率不到50%，而且操作繁琐，保护基脱除时要用到易爆高毒性的肼，并不适合工业化生产。化学合成法的弊端在于生产过程中不可避免的需要上保护基、进行反应后脱保护基等步骤，每一步都需要用到各种有机溶剂，其中包括很多有毒易爆的化学试剂，如肼。此外，化学合成路线中存在杂质百分比较高的问题（超过30%），导致整体收率和纯度偏低。

4、目前生物合成法主要是采用两步酶法，第一步催化是以l-组氨酸和β-丙氨酸为出发底物，经过肌肽合酶ywfe生成肌肽，然后再由转甲基酶催化合成鹅肌肽，其中第二步催化是在微生物细胞中进行。该合成路线存在酶催化效率不佳的问题，尤其是ywfe本身实验测定转化率只有2%，即使采用突变后的酶进行测定转化率也未见改善，与目前相关报道的转化率相差较大。

5、鉴于生物法目前所采用的肌肽水解酶ywfe存在实际转化率偏低的问题，导致目前工业上无法采用该路线进行鹅肌肽的大规模生产，因此亟需找寻一个实际转化率较高的酶来替换ywfe，并与转甲基酶一起合成鹅肌肽。此外，该生物合成路线未考虑到第二步酶法所需底物腺苷蛋氨酸的来源问题。腺苷蛋氨酸价格昂贵，不具有经济适用性，不适合工业规模化生产。采用微生物细胞进行合成也存在潜在的细胞对鹅肌肽的降解作用（由于细胞内存在多种天然的酯酶、蛋白酶等），从而影响产率。因此，目前需要提供一条起始物料廉价易得、工艺操作简单，可以适用于工业生产的鹅肌肽合成路线。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种基于体外全酶法的鹅肌肽制备方法，既规避了现有生物合成法的相关弊端，又避免了直接提取法和化学合成法收率较低等的瓶颈。本发明所采用的三种氨基酸底物相对廉价易得，通过体外全酶法可以规避微生物细胞对鹅肌肽的降解，进而提高鹅肌肽的收率。

2、本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：

3、一种基于体外全酶法的鹅肌肽制备方法，

4、采用分步反应法或一锅反应法，

5、分步反应法包括以下反应步骤：

6、（1）底物l-甲硫氨酸在甲硫氨酸腺苷基转移酶（metk， ec 2.5.1.6，ncbi geneid: 945389）的催化下生成腺苷蛋氨酸；

7、（2）底物l-组氨酸和β-丙氨酸在肌肽水解酶（smpepd，ec 6.3.2.11，ncbi geneid: 66716121）催化下生成肌肽；

8、（3）肌肽和腺苷蛋氨酸一起在鹅肌肽合酶（carnmt，ec 6.3.2.11，ncbi gene id:855632）催化下合成鹅肌肽；

9、一锅反应法为：将底物l-甲硫氨酸、l-组氨酸和β-丙氨酸以及甲硫氨酸腺苷基转移酶、肌肽水解酶和鹅肌肽合酶一同加入反应釜内催化生成鹅肌肽。

10、步骤（1）中，添加atp作为辅因子并提供能量；一锅反应法中添加atp作为辅因子并提供能量。

11、作为优选，所述atp由atp循环系统生成，atp循环系统包括adp激酶（ec 2.7.4.1，ncbi gene id: 946971）、循环启动用atp和焦磷酸钠，其中adp激酶浓度为0.1~10mg/l，循环启动用atp初始添加浓度为50~1000mg/l，焦磷酸钠初始添加浓度为50~1000mg/l，焦磷酸钠每隔1.5~2小时补加一次。

12、作为优选，步骤（1）中，酶促反应体系中：甲硫氨酸腺苷基转移酶用量为0.5~50mg/l，底物l-甲硫氨酸用量为1~100g/l；催化反应温度为20~40℃，ph控制在6-8。

13、作为优选，步骤（2）中，酶促反应体系中：肌肽水解酶用量为0.5~50mg/l，底物β-丙氨酸用量为1~100g/l，底物l-组氨酸用量为1~100g/l；催化反应温度为20~40℃，ph控制在6-8。

14、作为优选，步骤（3）中，酶促反应体系中：鹅肌肽合酶用量为0.5~50mg/l，底物腺苷蛋氨酸用量为1~100g/l，底物肌肽用量为1~100g/l；催化反应温度为20~40℃，ph控制在6-8。

15、作为优选，一锅反应法的酶促反应体系中：底物l-甲硫氨酸用量为1~100g/l，底物β-丙氨酸用量为1~100g/l，底物l-组氨酸用量为1~100g/l，甲硫氨酸腺苷基转移酶用量为0.5~50mg/l，肌肽水解酶用量为0.5~50mg/l，鹅肌肽合酶用量为0.5~50mg/l；催化反应温度为20~40℃，ph控制在6-8。

16、作为优选，整个制备过程中，酶促反应所用的缓冲体系为磷酸缓冲液或tris-hcl缓冲液。

17、作为优选，整个制备过程中使用的酶采用大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、酿酒酵母、毕赤酵母中的一种工程菌株表达生产。

18、本发明一共涉及4个酶，其中三个酶是参与鹅肌肽的合成，另一个酶是用于atp循环体系。

19、本发明设计的鹅肌肽全生物法合成路线中，相关酶蛋白的获取采用微生物发酵法，具体方法是将4个酶对应的基因序列分别整合到质粒pet-28上，然后分别转进大肠杆菌bl21(de3)里进行酶蛋白的表达，发酵完成后离心收集菌体，超声破碎离心获得酶液。质粒表达的各个酶的n端连接有his标签（his-tag），用于蛋白纯化。

20、本发明的有益效果是：

21、与直接提取法相比，本发明设计的鹅肌肽合成路线具有操作简单的优点，同时避开了原材料来源的限制，直接提取法还涉及到大量溶剂导致环保压力较大，不利于规模化生产。

22、与化学合成法相比，本发明设计的鹅肌肽合成路线具有路径短、操作简便、杂质少等优点，尤其是不需要使用有毒化学试剂和易爆化学品，具有很高的环境友好性。

23、本发明是体外全酶法，与目前的生物法合成鹅肌肽相比，本发明避开了使用微生物细胞进行细胞内合成，从而完全避免微生物细胞对鹅肌肽的降解作用，后续分离纯化也更为简便。