一种产己酸的复合微生物菌剂及其制备方法和应用

本发明涉及微生物制剂领域，具体涉及一种产己酸的复合微生物菌剂及其制备方法和应用。

背景技术：

1、厌氧生物处理技术能够将废弃物转化为能源或化工原料，具有废物处置和资源回收双重效益。厌氧消化作为目前广泛应用的生物处理技术，可以将废弃物转化为可再生能源甲烷，所产生的沼渣还可以作为优质的有机肥料。但是厌氧消化技术在处置废弃物的过程中也面临诸多挑战：(1)厌氧消化最终所产生的甲烷用途单一，且经济价值较低；(2)产甲烷菌群相对脆弱，容易受到废弃物快速酸化带来的冲击，导致整个系统运行的失稳甚至崩溃。针对于此，研究人员提出利用厌氧混合菌群产酸的思路。该技术通过化学或物理方法对厌氧混合菌群进行处理，抑制发酵系统内的产甲烷菌群活性从而切断厌氧消化过程中的产甲烷途径，使得中间代谢产物有机酸得以积累。这些中间产物主要以乙酸、丙酸和丁酸等短链羧酸为主。然而这些短链羧酸能量密度低，经济价值有限，且水溶性强，导致分离提纯过程能耗高，使得废弃物转化为短链羧酸产物技术在生产和下游工艺等方面仍然存在诸多不足。

2、为了克服上述厌氧生物处理技术所面临的问题，近年来一些研究人员提出了利用厌氧混合菌群将短链羧酸进一步转化为以己酸为代表的中链羧酸的研究思路。这项技术的出发点一方面是基于己酸等中链脂肪酸具有易分离提纯的特性。原因是相较于短链羧酸，其拥有更长的碳氢链(6个及以上的碳)，因此具有更低的水溶性而易于从发酵体系中分离。例如非解离态的己酸分子在水中溶解度仅为10.8g/l，而乙酸、丁酸等短链脂肪酸则可以与水任意比互溶。另一方面是基于己酸等中链脂肪酸的能量密度大，附加值高，应用广泛。己酸等中链羧酸可以进一步加工成为润滑油调理剂、高分子材料添加剂、油性涂料辅助剂、高热值燃料以及绿色杀虫药剂等，还可作为制药前体物和调味剂原料。经过资源回收后的应用场景广泛，且经济价值较高。而短链脂肪酸应用范围相对单一，应用价值有限。因此，如果能将废弃物通过厌氧生物过程高效的转化为己酸，并开发与其技术特点匹配的分离纯化工艺，可提供一项具有广阔应用前景的废弃物高值转化技术。

3、目前，利用废弃物生产己酸的主要方法是通过功能菌群富集和工艺调控，例如专利cn202010052792.2公开了一种氯仿和碳酸钙联合处理强化混合菌群产己酸的方法；专利cn201810301121.8公开了一种两相法厌氧发酵产己酸的方法；专利cn202010189970.6公开了一种利用餐厨垃圾发酵生产己酸的方法，利用餐厨垃圾为原料通过两阶段发酵制备己酸；专利cn202210710281.4公开了一种利用土壤作为接种菌源生产己酸的方法，通过向发酵基质中添加乙醇作为外加电子供体，添加乙酸作为外加电子受体，从土壤中快速筛选中产己酸的菌群；专利cn202110894226.0公开了一种基于ph调控的污泥生产己酸和庚酸的方法。这些现有的技术主要集中在菌群富集和工艺调控方面，而通过特定的复合微生物菌剂生产己酸的研究并无相关报道。鉴于此，本发明提供一种产己酸的复合微生物菌剂及其制备方法和应用。

技术实现思路

1、本发明所要解决的技术问题是提供一种产己酸的复合微生物菌剂及其制备方法和应用。目的是通过复合微生物菌剂发酵生产己酸，为食用香料、药物及工业用品提供原材料。

2、本发明解决上述技术问题的技术方案如下：

3、第一方面是提供一种产己酸的复合微生物菌剂，所述的复合微生物菌剂包括丁酸梭菌、运动发酵单胞菌和科氏梭菌，所述的复合微生物菌剂中所述丁酸梭菌、所述运动发酵单胞菌和所述科氏梭菌的活菌数量比为1.0±0.1：3.0±0.1：4.0±0.1.

4、其中，丁酸梭菌发酵产生乙酸和丁酸，运动发酵单胞菌产生乙醇，科氏梭菌利用乙醇/乙酸、丁酸产生己酸。上述的丁酸梭菌(clostridium butyricum atcc 19398)，运动发酵单胞菌(zymomonas mobilis atcc 31821)，科氏梭菌(clostridium kluyveri atcc12489)来自实验室保存菌株，可以从美国模式培养物寄存库(atcc)或者中国工业微生物菌种保藏中心购买。

5、进一步，所述的复合微生物菌剂包括丁酸梭菌、运动发酵单胞菌和科氏梭菌，所述的复合微生物菌剂中所述丁酸梭菌、所述运动发酵单胞菌和所述科氏梭菌的活菌数量比为。

6、进一步，所述的复合微生物菌剂为液态菌剂或冻干粉。

7、进一步，所述的复合微生物菌剂为液态菌剂时，细菌的浓度为1.4ⅹ109±8.5ⅹ107cfu/ml；所述的复合微生物菌剂为冻干粉时，细菌的浓度为1.26ⅹ1012±7.7ⅹ1010cfu/g。

8、第二方面提供一种产己酸的复合微生物菌剂的制备方法，包括如下步骤：

9、将丁酸梭菌、运动发酵单胞菌和科氏梭菌分别进行厌氧活化，得到丁酸梭菌悬浊液、运动发酵单胞菌悬浊液和科氏梭菌悬浊液；

10、将所述丁酸梭菌悬浊液、所述运动发酵单胞菌悬浊液和所述科氏梭菌悬浊液接种至公共培养基中，进行厌氧发酵，得到复合微生物菌母液；

11、将所述复合微生物菌母液接种至液态扩培培养基中，进行厌氧发酵，得到液态的所述的复合微生物菌剂。

12、进一步，步骤(2)中接种至公共培养基中丁酸梭菌、运动发酵单胞菌和科氏梭菌悬的活菌数量比为1.0±0.1：3.0±0.1：4.0±0.1，所述复合微生物菌母液中细菌的浓度为1.4ⅹ109±8.5ⅹ107cfu/ml。

13、进一步，步骤(2)中接种至公共培养基中丁酸梭菌、运动发酵单胞菌和科氏梭菌的活菌数量比为1.0±0.1：3.0±0.1：4.0±0.1。

14、进一步，步骤(2)中每升的所述公共培养基包括以下成分：k2hpo4·3h2o0.41g，kh2po4 0.23g，nh4cl 0.25g，mgso4 0.10g，酵母提取物10.0g，微量元素溶液sl-10 1.0ml，st溶液1.0ml，质量分数为0.1％的na-resazurin0.5ml，l-cysteine-hcl 0.25g，na2s·9h2o0.25g，维生素溶液1.0ml。

15、其中，上述sl-10包括hcl(25％)10.00ml/l、fecl2·4h2o 1.50g/l、zncl270.00mg/l、mncl2·4h2o 100.00mg/l、h3bo3 6.00mg/l、cocl2·6h2o 190.00mg/l、cucl2·2h2o2.00mg/l、nicl2·6h2o 24.00mg/l、na2moo4·2h2o 36.00mg/l；st溶液包括naoh 0.50g/l、na2seo3·5h2o 3.00mg/l、na2wo4·2h2o4.00mg/l；维生素溶液包括vitamin b12(维生素b12)100.00mg/l、p-aminobenzoic acid(对氨基苯甲酸)80.00mg/l、d-(+)-biotin(d-(+)-生物素)20.00mg/l、nicotinic acid(烟酸)200.00mg/l、calcium pantothenate(泛酸钙)100.00mg/l、pyridoxine hydrochloride(盐酸吡哆醇)300.00mg/l、thiamine-hcl·2h2o(盐酸硫胺)200.00mg/l。

16、进一步，步骤(2)和(3)中，均为在发酵温度为37±1℃，搅拌速度为180-250rpm的条件下进行厌氧发酵。

17、进一步，步骤(3)中所述液态扩培培养基成分与步骤(2)中公共培养基相同。

18、第三个方面是提供一种产己酸的复合微生物菌剂的应用，所述一种产己酸的复合微生物菌剂可用于含糖废水、秸秆、厨余垃圾等废弃物的资源化利用。

19、与现有技术相比，本发明具有如下效果：

20、(1)相比于现有的菌群富集(强化)和工艺调控的方法，本发明通过不同种类菌剂的合理配比得到的复合微生物菌剂，具有制备工艺简单、培养周期短、成本和能耗低、稳定性良好的优势，同时效益显著，具有广阔的市场应用前景。

21、(2)本发明通过合理菌种搭配来实现复合微生物菌剂产己酸，当复合微生物菌剂中丁酸梭菌/运动发酵单胞菌/科氏梭菌接种比例为1.0±0.1：3.0±0.1：4.0±0.1时，己酸产量达到1.47g/l。

22、(3)本发明的复合微生物菌剂可用于含糖废水、秸秆、厨余垃圾等废弃物的资源化利用。