一种基于飞行时间质谱法结合拷贝数对地中海贫血症基因分型的引物组和试剂盒的制作方法

本发明涉及基因检测，具体地，涉及一种基于飞行时间质谱法结合拷贝数对地中海贫血症基因分型的引物组和试剂盒。

背景技术：

1、地中海贫血是一组以一个或多个血红蛋白（hb）链合成缺陷为特征的异质性遗传病，这会导致不稳定的非地中海血型hb链的积累，从而沉淀并导致外周血中红系前体细胞的髓内破坏和红细胞的过早溶解。地中海贫血主要可分为：α-地中海贫血，α珠蛋白亚基生成缺失或减少；β-地中海贫血，β珠蛋白链产生缺失或减少；δβ-地中海贫血，δ珠蛋白和β珠蛋白亚基的产生减少或不存在。

2、正常人类受试者有两对α珠蛋白基因和一个αα/αα基因型。与之相反，在α-地中海贫血中，受影响的染色体可能会缺失一个或两个基因。总体而言，2种主要的原因会导致α-地中海贫血：

3、（1）单个α珠蛋白基因缺失，定义为α+-地中海贫血。常见的两种α+-地中海贫血是-α3.7型和-α4.2型，导致α链产生减少。一个（-α/αα）或两个（--/αα，-α/-α）α珠蛋白等位基因的缺失都会导致无症状的α-地中海贫血，这些疾病的特征是α和非α珠蛋白链合成之间的不平衡，导致红细胞参数的轻度至中度变化。

4、（2）一条染色体上的α珠蛋白基因簇（包括两个α等位基因）全部或部分缺失会导致α0-地中海贫血。α样珠蛋白基因（即hbz（ζ-珠蛋白）、hba2（α2-珠蛋白）和hba1（α1-珠蛋白））失活导致过多的β-珠蛋白链产生，在出生后形成β4四聚体（hbh）。从遗传学的角度来看，这些个体是由α+和α0突变的复合杂合性（--/-α）所致。hbh变异体极不稳定，通常在红细胞内沉淀，导致hbh病。4个α珠蛋白基因均缺失或缺陷，以致完全无α链生成，因而含有α链的hba、hba2和hbf的合成均减少，这种α0-地中海贫血的纯合子状态引起的疾病称为hbbarts胎儿水肿综合征，受累胎儿会有严重的缺血缺氧，全身水肿，多数胎死腹中或于分娩后半小时死亡。

5、根据突变和缺失的大小和/或位置，β-地中海贫血可分为以下几种：β0-地中海贫血、δβ-地中海贫血、遗传性持续性胎儿血红蛋白增高症（hpfh）、γδβ-地中海贫血和εγδβ-地中海贫血。绝大多数β-地中海贫血是由β-珠蛋白基因点突变或其相邻侧翼区域引起的，β-珠蛋白基因上游的部分缺失相对较少。

6、β肽链基因上不同位点突变会导致β肽链合成量不同，将那些突变使得β肽链减少但并非完全缺失的定义为β+，若突变导致β肽链完全不合成，则定义为β0。其中，若有一个正常β基因，无论突变的基因是β0还是β+，一般为轻型β-地中海贫血，血常规和血红蛋白有异常，但对于携带者的生活影响较少。在杂合子β基因突变中，地中海贫血中cd53这个突变由于发生了移码突变，使得红细胞非常不稳定，其杂合子患者可导致中间型地中海贫血，其对于患者生活有一定影响。而纯合子突变，即两个β基因都有突变的地中海贫血患者多半为中间型或者重型地中海贫血。中间型β-地中海贫血患者由于基因突变类型不同，其贫血程度也有所不同。

7、当夫妇双方均为同一类型（α-或β-）地中海贫血基因携带者时，其后代有四分之一的机会罹患重型α-或β-地中海贫血。通过地中海贫血筛查和诊断，防止重型地贫患儿的出生是必要的措施。通过血常规、血红蛋白电泳分析以及基因诊断来筛查孕育夫妇生育重型地贫患儿的可能性，最后通过对胎儿进行产前诊断，确认为重型地贫患儿则终止妊娠。

8、目前，临床上常用亚能生物技术（深圳）有限公司以及达安基因提供gap-pcr法联合pcr-反向点杂交法检测α-地中海贫血，该方法在α-地中海贫血的分子筛查和临床诊断中发挥了很大的作用，但该方法在对pcr扩增产物分析时容易造成dna交叉污染，而且操作繁琐不适用于大规模检测。近年来，具有高通量、高集成、微型化、连续化和自动化等特点的微阵列芯片法被应用于α-地中海贫血检测。博奥生物集团有限公司的微阵列芯片法在α-地中海贫血检测中可同时检测缺失型和非缺失型，减少了实验步骤，提高了工作效率，同时可实现连续化和自动化，能满足大规模检测需求。但是，微阵列芯片法容易造成漏检，不能检出泰国型缺失，而泰国型缺失复合东南亚型缺失的双杂合子表型为典型的巴氏水肿胎，因此泰国型缺失的检出意义尤为重要，上述问题使得该检测方法存在比较明显的不足之处；另外，该方法对设备要求较高，试剂成本也较高。

技术实现思路

1、本发明要解决的技术问题是现有技术中存在的上述缺陷与不足，提供一种基于飞行时间质谱法结合拷贝数对地中海贫血症基因分型的引物组和试剂盒。

2、本发明的第一个目的是提供一种基于飞行时间质谱法结合拷贝数对地中海贫血症基因分型的扩增引物。

3、本发明的第二个目的是提供一种基于飞行时间质谱法结合拷贝数对地中海贫血症基因分型的延伸引物。

4、本发明的第三个目的是提供一种基于飞行时间质谱法结合拷贝数对地中海贫血症基因分型的组合物。

5、本发明的第四个目的是提供上述的扩增引物、延伸引物和/或组合物在制备用于地中海贫血症检测和/或基因分型的产品中的应用。

6、本发明的第五个目的是提供一种用于地中海贫血症基因分型的试剂盒。

7、本发明的第六个目的是提供一种基于飞行时间质谱法结合拷贝数对地中海贫血症基因分型的反应体系。

8、为了实现上述目的，本发明是通过以下方案予以实现的：

9、本发明针对地中海贫血症常见突变位点的序列设计基于飞行时间质谱法结合拷贝数对地中海贫血症基因分型的扩增引物和延伸引物，并建立了检测方法：提取全血基因组dna后，通过多重pcr反应、sap反应和单碱基延伸（uep）反应得到反应产物，采用飞行时间质谱仪进行分析。检测结果用typer 4.0软件自动分析，并将各位点峰面积导出至excel文件。根据延伸引物及引物延伸后分子量大小所对应的质谱峰图，判读目标位点上为何种基因型，判断原则为：当检测范围内位点的野生型及突变型中至少一个峰的峰高≥1时，snr≥3时，则认为结果可靠，可进行下一步判定：根据突变型峰值∕野生型峰值进行判定，如果峰高比＞3则判定为纯合突变（野生型峰值为0时，其峰高比接近无穷大，也符合该判定），如果0.5≤峰高比≤3，则判读为杂合突变，其他情况（也就是如果＜0.5），则判读为野生型。

10、因此，本发明要求保护以下内容：

11、一种基于飞行时间质谱法结合拷贝数对地中海贫血症基因分型的扩增引物，所述扩增引物的核苷酸序列如seq id no.1～10所示。

12、一种基于飞行时间质谱法结合拷贝数对地中海贫血症基因分型的延伸引物，所述延伸引物的核苷酸序列如seq id no.11～40所示。

13、一种基于飞行时间质谱法结合拷贝数对地中海贫血症基因分型的组合物，所述组合物包含上述的扩增引物和延伸引物。

14、优选地，所述组合物能够实现在多重pcr和单碱基延伸反应中，在同一反应体系（单管反应）中对地中海贫血症的相关基因突变进行扩增和单碱基延伸反应，较为全面地覆盖常见的基因突变位点，且具有较高的灵敏度和准确性。

15、单管反应能够极大地提高检测效率，但若有需要，本发明的上述引物组也能够进行分管反应。

16、优选地，上述组合物覆盖的突变包括：α-地贫的4种常见缺失（--sea、-α3.7、-α4.2、--thai）和3种点突变型（-αcs、-αqs、-αws）及β-地贫的23种致病性变异位点：-28 (a>g)、-29 (a>g)、-30 (t>c)、-32 (c>a)、-50 (g>a)、-73 (a>t)、-90 (c>t)、cap +1 (a>c)、cap 41-44(-aaca)、cd 113 gtg>gag、cd 26 (gag>aag)、cd 27/28 (+c)、cd 30 (a>g)、cd 31 (-c)、cd 71/72 (+a)、cd 8/9 (+g)、init cd (atg>agg)、ivs i-1 (g>t/a)、ivs i-5 (g>c)、ivsii-2 (-t)、ivs ii-654 (c>t)、ivs ii-705 (t>g)、ivs ii-806 (g>c)。

17、上述的扩增引物、延伸引物和/或组合物在制备用于地中海贫血症检测和/或基因分型的产品中的应用。

18、一种用于地中海贫血症基因分型的试剂盒，所述试剂盒包含上述的扩增引物和/或上述的延伸引物。

19、优选地，所述试剂盒还包含多重pcr检测试剂、sap反应试剂和单碱基延伸反应试剂中的一种或几种。

20、更优选地，多重pcr反应试剂包括pcr反应缓冲液、mg2+、dntps、dna聚合酶、水中的一种或几种；

21、sap反应试剂包括sap反应缓冲液、sap酶、水中的一种或几种；

22、单碱基延伸反应试剂包括单碱基延伸反应缓冲液、单碱基延伸反应终止液、单碱基延伸反应酶、水中的一种或几种；

23、上述各反应试剂中的一种或多种可以预混液形式提供。

24、更优选地，所述试剂盒含有扩增引物混合物，所述扩增引物混合物由核苷酸序列如seq id no.1～10所示的引物混合而成，核苷酸序列如seq id no.1～10所示的引物的浓度依次为：1.5 μm、1.5 μm、1 μm、1 μm、2 μm、2μm、2 μm、2μm、1 μm、1 μm。

25、更优选地，所述试剂盒含有延伸引物混合物，所述延伸引物混合物由核苷酸序列如seq id no.11～40所示的引物混合而成，核苷酸序列如seq id no.11～40所示的引物的浓度依次为：792/145 μm、711/145 μm、774/145 μm、684/145 μm、783/145 μm、1035/145 μm、927/145 μm、936/145 μm、846/145 μm、1071/145 μm、1107/145 μm、990/145 μm、1053/145 μm、603/145 μm、1044/145 μm、873/145 μm、999/145 μm、540/145 μm、846/145 μm、999/145 μm、1044/145 μm、864/145 μm、954/145 μm、999/145 μm、819/145 μm、648/145 μm、558/145 μm、1179/145 μm、1368/145 μm、1467/145 μm。

26、优选地，上述的试剂盒基于飞行时间质谱法对地中海贫血症进行基因分型，所述基因分型包括以下步骤：

27、s1. 以待测样本的基因组dna为模板，采用核苷酸序列如seq id no.1～10所示的扩增引物进行多重pcr扩增，得到pcr反应产物；

28、s2. 将所述pcr反应产物与sap反应试剂混合进行sap反应得到sap反应产物；

29、s3. 将所述sap反应产物、单碱基延伸反应试剂以及核苷酸序列如seq id no.11～40所示的延伸引物混合，进行单碱基延伸反应，得到单碱基延伸反应产物；

30、s4. 对所述单碱基延伸反应产物进行飞行时间质谱检测。

31、优选地，在多重pcr扩增反应体系中，待测样本的基因组dna的添加量为5～100ng。

32、优选地，所述多重pcr反应的反应条件为95℃ 3min；95℃ 30 s、60℃ 30 s、72℃30 s，45个循环；72℃ 5min。

33、优选地，所述单碱基延伸反应的反应条件为94℃ 30 s；以下程序40个循环：95℃5 s，1个循环，52℃ 5 s、80℃ 5s，5个循环；72℃ 3min。

34、优选地，结果判断方法如下：根据延伸引物及引物延伸后分子量大小所对应的质谱峰图，判读目标位点上为何种基因型，判断原则为：当检测范围内位点的野生型及突变型中至少一个峰的峰高≥1时，snr≥3时，则认为结果可靠，可进行下一步判定：根据突变型峰值∕野生型峰值进行判定，如果峰高比＞3则判定为纯合突变（野生型峰值为0时，其峰高比接近无穷大，也符合该判定），如果0.5≤峰高比≤3，则判读为杂合突变，其它情况（也就是如果＜0.5），则判读为野生型。

35、一种基于飞行时间质谱法结合拷贝数对地中海贫血症基因分型的反应体系，所述反应体系包含扩增体系和延伸体系；

36、所述扩增体系中含有上述的扩增引物，所述延伸体系中含有上述的延伸引物。

37、优选地，所述扩增体系中，核苷酸序列如seq id no.1～10所示的各条扩增引物的浓度为0.1～0.2 μm；

38、所述延伸体系中，核苷酸序列如seq id no.11～40所示的各条延伸引物的浓度为0.6～1.63 μm。

39、更优选地，所述扩增体系中，核苷酸序列如seq id no.1～10所示的各条扩增引物的终浓度依次为：0.15 μm、0.15 μm、0.1 μm、0.1 μm、0.2 μm、0.2 μm、0.2 μm、0.2 μm、0.1μm、0.1 μm；

40、所述延伸体系中，核苷酸序列如seq id no.11～40所示的各条延伸引物的终浓度依次为：0.88 μm、0.79 μm、0.86 μm、0.76 μm、0.87 μm、1.15 μm、1.03 μm、1.04 μm、0.94 μm、1.19 μm、1.23 μm、1.10 μm、1.17 μm、0.67 μm、1.16 μm、0.97 μm、1.11 μm、0.6 μm、0.94μm、1.11 μm、1.16 μm、0.96 μm、1.06 μm、1.11 μm、0.91 μm、0.72 μm、0.62 μm、1.31 μm、1.52 μm、1.63 μm。

41、更优选地，所述反应体系还包含多重pcr检测试剂、sap反应试剂和单碱基延伸反应试剂中的一种或几种。

42、优选地，上述的反应体系基于飞行时间质谱法对地中海贫血症进行基因分型，所述基因分型包括以下步骤：

43、s1. 以待测样本的基因组dna为模板，采用核苷酸序列如seq id no.1～10所示的扩增引物进行多重pcr扩增，得到pcr反应产物；

44、s2. 将所述pcr反应产物与sap反应试剂混合进行sap反应得到sap反应产物；

45、s3. 将所述sap反应产物、单碱基延伸反应试剂以及核苷酸序列如seq id no.11～40所示的延伸引物混合，进行单碱基延伸反应，得到单碱基延伸反应产物；

46、s4. 对所述单碱基延伸反应产物进行飞行时间质谱检测。

47、更优选地，在多重pcr扩增反应体系中，待测样本的基因组dna的添加量为5～100ng。

48、更优选地，所述多重pcr反应的反应条件为95℃ 3min；95℃ 30 s、60℃ 30 s、72℃ 30 s，45个循环；72℃ 5min。

49、优选地，所述单碱基延伸反应的反应条件为94℃ 30 s；以下程序40个循环：95℃5 s，1个循环，52℃ 5 s、80℃ 5s，5个循环；72℃ 3min。

50、优选地，结果判断方法如下：根据延伸引物及引物延伸后分子量大小所对应的质谱峰图，判读目标位点上为何种基因型，判断原则为：当检测范围内30个位点的野生型及突变型中至少一个峰的峰高≥1时，snr≥3时，则认为结果可靠，可进行下一步判定：根据突变型峰值∕野生型峰值进行判定，如果峰高比＞3则判定为纯合突变（野生型峰值为0时，其峰高比接近无穷大，也符合该判定），如果0.5≤峰高比≤3，则判读为杂合突变，其它情况（也就是如果＜0.5），则判读为野生型。

51、优选地，在多重pcr扩增反应体系中，待测样本的基因组dna的添加量为5～100ng。

52、优选地，所述多重pcr反应的反应条件为95℃ 3min；95℃ 30 s、60℃ 30 s、72℃30 s，45个循环；72℃ 5min。

53、优选地，所述单碱基延伸反应的反应条件为94℃ 30 s；以下程序40个循环：95℃5 s，1个循环，52℃ 5 s、80℃ 5s，5个循环；72℃ 3min。

54、上述用于地中海贫血症基因分型的组合物、所述用于地中海贫血症基因分型的试剂盒和所述用于地中海贫血症基因分型的反应体系在检测地中海贫血症相关基因的基因型中的应用。

55、以上所述的应用为非疾病诊断和治疗目的的应用。

56、与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

57、本发明公开了一种基于飞行时间质谱法结合拷贝数对地中海贫血症基因分型的引物组和试剂盒。本发明提供的引物组较为全面地覆盖了常见的地中海贫血相关基因热点突变及缺失，与其他产品相比，增加对泰国型地中海贫血的检测，使得产品覆盖更广泛的地中海贫血类型，检出率更高，也更为准确。

58、本发明的引物组能够通过单管反应同时检测地中海贫血症珠蛋白基因α和β的相关突变，确定珠蛋白基因α和β的峰高和snr值，同时检测中国人群地贫常见的、包括泰国型在内的30个热点突变，具有高准确性、高灵敏度、高通量的特点，适于推广和应用。

59、本发明的引物组和试剂盒利用飞行时间质谱法结合拷贝数对地中海贫血症进行基因分型，操作简单、检测成本低、检测结果稳定可靠、通量高，适用于进行临床大规模人群筛查，适用对象包括疑似地中海贫血症的患者，确诊地中海贫血症的患者，或有地中海贫血症家族病史等高危人群，可以对正常人、携带者和患者进行准确的基因分型筛查，用于地中海贫血症患者的辅助临床诊断和携带者、新生儿的筛查，既可应用于临床诊断，也可以应用于地中海贫血携带者筛查以及地贫的一二三级预防。

60、与现有产品相比，本发明的引物组和试剂盒至少具有以下优势：

61、（1）高精准度、低复查率：本发明的引物组能够实现在同一反应体系中高效地进行目标片段的扩增和突变的延伸反应，配合massarray dna飞行质谱分析系统进行基因分型，可高灵敏度和高精确度地快速分析待测样本的突变类型。本发明的引物组和方法在测定下限（2.5 ng/μl）时的检测结果与已知基因型结果符合率为100%。

62、（2）应用范围广：本发明的检测试剂盒可同时对地中海贫血所涉及的缺失以及常见的热点突变进行检测，并且较其他产品增加了对泰国型地贫的检测，检测覆盖范围广，既可应用于开展地中海贫血的一级、二级、三级预防，也可辅助于临床诊断，得到更精准的诊断结果。

63、（3）检测通量高：根据目前的massarray dna飞行质谱分析系统机型，最多每次可以处理384×2个样本，每天可以处理6～8块芯片，高通量（3000～5000人份/天），能够满足大样本量筛查的应用需求。