NK细胞的体外扩增方法与流程

本发明涉及一种nk细胞的体外扩增方法，属于细胞培养。

背景技术：

1、肿瘤一直以来都是困扰人类健康的头等问题，由于其复杂性、多变性和异质性的特点，因此一直找不到有效的治疗方法。在过去的十年中，免疫疗法在癌症治疗方面取得了巨大进展，其原理是采集人体的淋巴细胞，经过体外激活、扩增、筛选或修饰后得到大量的具有高杀伤性能的淋巴细胞再回输到患者体内，从而进行肿瘤细胞的杀伤。虽然大多数免疫治疗策略都是基于t细胞的使用，但是研究表明自然杀伤(natural killer，nk)细胞具有巨大的免疫治疗潜力。

2、nk细胞属于淋巴细胞，占人外周血淋巴细胞的10％～20％，占脐带血淋巴细胞的5％，可在没有抗原预先致敏的情况下非特异性杀伤肿瘤细胞和病毒感染细胞。值得注意的是，人体自身nk细胞的含量有限，且nk细胞无法自然产生体内扩增、存活以及细胞毒性作用所必需的细胞因子。因此，获得足够数量的nk细胞，同时保持nk细胞具有较高的纯度和杀伤能力，是nk细胞在临床应用方面的一个关键技术障碍。目前，nk细胞的体外扩增主要分为两大类技术方法，滋养层细胞作为主流的技术方法，有扩增迅速、效率高的特点，但因滋养层细胞存在致瘤、污染等风险，限制了其在临床的应用；第二类技术方法是细胞因子法，常用的方法是通过il2、il7等细胞因子对单个核细胞进行刺激，诱导其向nk方向分化扩增，这种方法安全性高，但扩增的nk细胞纯度低，一般在55％～80％之间，且杀伤性能低。

技术实现思路

1、针对上述现有技术，本发明提供了一种nk细胞的体外扩增方法，利用本发明的方法得到的nk细胞为高效能nk细胞，纯度高，且杀伤能力高。

2、本发明是通过以下技术方案实现的：

3、一种nk细胞的体外扩增方法，如下：使用活化培养基重悬单个核细胞，调节细胞密度为1.0×106～2.0×106个/ml，以2ml/孔的体积加入到cd16和nkp46抗体包被的细胞培养板中，置于二氧化碳培养箱中培养21天以上，其中，第1～4天使用活化培养基进行培养，第5天起使用扩增培养基进行补液培养，之后每2天补液一次，补液的同时调节nk细胞密度为1.0×106～1.2×106个/ml；至第21天，收取大量高纯度和高杀伤能力的nk细胞。

4、所述活化培养基，是在nk细胞扩增无血清培养基的基础上添加自体血浆、il2、il15、il18、il21和il27得到的，其中，自体血浆的添加量为8％～12％(体积百分数，下同)，优选10％，il2、il15、il18、il21和il27的终浓度分别为45～55u/ml、45～55ng/ml、90～110ng/ml、4～6ng/ml和4～6ng/ml，优选的，il2、il15、il18、il21和il27的终浓度分别为50u/ml、50ng/ml、100ng/ml、5ng/ml和5ng/ml。所述nk细胞扩增无血清培养基是现有技术中已有的商品化培养基，可市场购买得到。

5、所述扩增培养基，是在nk细胞扩增无血清培养基的基础上添加自体血浆和il2得到的，其中，自体血浆的添加量为8％～12％，优选10％，il2的终浓度为45～55u/ml，优选50u/ml。

6、进一步地，所述cd16和nkp46抗体包被的细胞培养板，是通过以下方式得到的：用含cd16和nkp46的抗体包被液包被tc处理的细胞培养板，置于4℃孵育10～14小时，pbs缓冲液洗涤，备用；所述抗体包被液中，cd16的浓度为0.2～0.6μg/ml，优选0.5μg/ml，nkp46的浓度为0.2～0.6μg/ml，优选0.5μg/ml。

7、优选的，使用活化培养基重悬单个核细胞后，调节细胞密度为1.5×106个/ml。

8、进一步地，所述二氧化碳培养箱中的培养条件为：37℃，5％co2，饱和湿度。

9、进一步地，所述使用活化培养基进行培养时，第2天或第3天补液一次。

10、进一步地，所述自体血浆是通过以下方法得到的：脐带血离心分离得到血浆和全血细胞，将血浆置于56℃水浴锅中灭活30min，置于4℃冷却30min，离心，即得。

11、进一步地，所述单个核细胞是通过以下方法分离得到的：脐带血离心分离得到血浆和全血细胞，将全血细胞与生理盐水混匀，缓慢加入到淋巴细胞分离液的上层，通过密度梯度离心法分离，得到淋巴细胞，再加入生理盐水，离心洗涤3次后，获得单个核细胞。

12、本发明的nk细胞的体外扩增方法，利用cd16和nkp46抗体结合包被细胞培养板，同时添加il2、il15、il18、il21和il27这五种细胞因子协同刺激nk细胞，诱导nk细胞的分化与成熟，获得的nk细胞纯度高，杀伤性能高。本发明的nk细胞的体外扩增方法，操作简单，安全性高，无需通过磁珠分选，可直接通过培养单个核细胞，诱导和扩增出大量纯度高、杀伤性能高的nk细胞，具有很高的临床应用价值。

技术特征：

1.一种nk细胞的体外扩增方法，其特征在于：使用活化培养基重悬单个核细胞，调节细胞密度为1.0×106～2.0×106个/ml，加入到cd16和nkp46抗体包被的细胞培养板中，置于二氧化碳培养箱中培养21天以上，其中，第1～4天使用活化培养基进行培养，第5天起使用扩增培养基进行补液培养，之后每2天补液一次，补液的同时调节nk细胞密度为1.0×106～1.2×106个/ml；

2.根据权利要求1所述的nk细胞的体外扩增方法，其特征在于：所述活化培养基中，自体血浆的添加量为10％，il2、il15、il18、il21和il27的终浓度分别为50u/ml、50ng/ml、100ng/ml、5ng/ml和5ng/ml。

3.根据权利要求1所述的nk细胞的体外扩增方法，其特征在于：所述扩增培养基中，自体血浆的添加量为10％，il2的终浓度为50u/ml。

4.根据权利要求1所述的nk细胞的体外扩增方法，其特征在于，所述cd16和nkp46抗体包被的细胞培养板，是通过以下方式得到的：用含cd16和nkp46的抗体包被液包被tc处理的细胞培养板，置于4℃孵育10～14小时，pbs缓冲液洗涤，备用；所述抗体包被液中，cd16的浓度为0.2～0.6μg/ml，nkp46的浓度为0.2～0.6μg/ml。

5.根据权利要求4所述的nk细胞的体外扩增方法，其特征在于：所述抗体包被液中，cd16的浓度为0.5μg/ml，nkp46的浓度为0.5μg/ml。

6.根据权利要求1所述的nk细胞的体外扩增方法，其特征在于：所述二氧化碳培养箱中的培养条件为：37℃，5％co2，饱和湿度。

7.根据权利要求1所述的nk细胞的体外扩增方法，其特征在于：所述使用活化培养基重悬单个核细胞后，调节细胞密度为1.5×106个/ml。

8.根据权利要求1所述的nk细胞的体外扩增方法，其特征在于：所述使用活化培养基进行培养时，第2天或第3天补液一次。

9.根据权利要求1所述的nk细胞的体外扩增方法，其特征在于，所述自体血浆是通过以下方法得到的：脐带血离心分离得到血浆和全血细胞，将血浆置于56℃水浴锅中灭活30min，置于4℃冷却30min，离心，即得。

10.根据权利要求1所述的nk细胞的体外扩增方法，其特征在于，所述单个核细胞是通过以下方法分离得到的：脐带血离心分离得到血浆和全血细胞，将全血细胞与生理盐水混匀，缓慢加入到淋巴细胞分离液的上层，通过密度梯度离心法分离，得到淋巴细胞，再加入生理盐水，离心洗涤3次后，获得单个核细胞。

技术总结
本发明公开了一种NK细胞的体外扩增方法：使用活化培养基重悬单个核细胞，加入到CD16和NKp46抗体包被的细胞培养板中，培养21天以上，第1～4天使用活化培养基进行培养，第5天起使用扩增培养基进行补液培养；所述活化培养基是在NK细胞扩增无血清培养基的基础上添加自体血浆、IL2、IL15、IL18、IL21和IL27得到的；所述扩增培养基是在NK细胞扩增无血清培养基的基础上添加自体血浆和IL2得到的。本发明利用CD16和NKp46抗体结合包被细胞培养板，同时添加IL2、IL15等五种细胞因子协同刺激NK细胞，诱导NK细胞的分化与成熟，获得的NK细胞纯度高，杀伤性能高，具有很高的临床应用价值。

技术研发人员：郭芳蕾,张癸荣,李明月,刘璇,谢斯谈
受保护的技术使用者：山东银丰生命科学研究院
技术研发日：
技术公布日：2024/4/17