一种高效表达非特异性过氧化酶毕赤酵母重组菌株的构建方法

本发明属于基因工程，具体涉及一种高效表达非特异性过氧化酶毕赤酵母重组菌株的构建方法。

背景技术：

1、茶树菇(agrocybeaegerita)的非特异性过氧化酶(aaeupo)是高度糖基化的硫代血红素酶，upo是以h2o2为电子受体，不需要任何辅因子，与p450酶相比具有独特的优势。aaeupo可催化脂肪族和芳香族化合物的羟基化、环氧化、脱烷基等反应。

2、除此之外，aae upo也成功应用于医疗行业，aae upo催化胆钙化醇和麦角钙化醇生成25-单羟基维生素(lucas f,babot e d,m,et al.catal sci technol,2016,6(1):288-295)，该产物既是维生素，也是一种类固醇激素，它在促进钙的吸收利用、调节激素分泌和免疫功能等方面均发挥重要作用，是人类健康重要的化合物。

3、但aae upo的活性和表达量较低，这一因素成为了其在工业上大规模应用的主要限制因素。利用大肠杆菌生产upo，无法对upo进行糖基化等翻译后加工，存在二硫键和空间构象折叠不正确等问题，因此得到具有生物活性的蛋白的几率较小。然而利用黑曲霉表达upo，内源蛋白分泌会竞争性消耗黑曲霉upo表达通路中的资源，降低表达量，且不利于upo的下游分离纯化。

4、毕赤酵母表达系统具有分泌型的表达形式，可获得了很多高产量的可溶性蛋白，且甲醇诱导型毕赤酵母菌株在真核蛋白表达及分析中非常有用，具有成本低、易于操作、适用于大规模发酵制备等优点。毕赤酵母具有进行糖基化修饰功能，有利于糖蛋白upo的功能表达、毕赤酵母表达系统表达的蛋白与天然蛋白的活性和构象更接近，这为后续蛋白的分离纯化奠定了基础。

技术实现思路

1、针对现有技术存在的问题，本发明的目的在于设计提供一种高效表达非特异性过氧化酶毕赤酵母重组菌株的构建方法的技术方案。本发明以毕赤酵母gs115为出发菌，以茶树菇非特异性过氧化物酶突变体pada-i为基础，通过易错pcr文库构建、构建高拷贝菌株和共表达分子伴侣蛋白，构建了一种重组毕赤酵母菌株，从而提供了一种提高茶树菇非特异性过氧化物酶活性的方法。

2、本发明具体采用以下技术方案实现：

3、本发明第一方面提供了一种高效表达非特异性过氧化酶毕赤酵母重组菌株的构建方法，其包括以下步骤：

4、1)构建质粒：以茶树菇非特异性过氧化物酶突变体pada-i为基础，采用spgma信号肽代替毕赤酵母内源信号肽，将spgma信号肽与线性化质粒克隆连接得到重组质粒，所述spgma信号肽序列如seq id no:2所示；

5、2)易错pcr突变体库构建：以步骤1)得到的重组质粒为模板进行易错pcr扩增获得易错pcr产物，将易错pcr产物与线性化质粒克隆连接获得重组质粒，将重组质粒ⅱ转入毕赤酵母，并筛选阳性转化子，所有转化子构成易错pcr突变体库；从易错pcr突变体库中筛选出成功构建的重组质粒和重组菌株；

6、3)高拷贝菌株的构建：将步骤2)得到的重组质粒转入毕赤酵母，筛选得到高拷贝重组菌株；

7、4)共表达分子伴侣：将步骤3)得到的高拷贝重组菌株进行分子伴侣共表达优化，并验证其是否能够稳定表达，得到重组酵母菌株。

8、进一步，所述线性化质粒为ppiczαa-pada-i，所述质粒载体为ppiczαa。

9、进一步，所述毕赤酵母为毕赤酵母gs115。

10、进一步，所述分子伴侣包括hac1、pdi和ero1。

11、本发明第二方面提供了上述任一方法制备的高效表达非特异性过氧化酶毕赤酵母重组菌株。

12、本发明第三方面提供了信号肽优化和伴侣共表达优化的组合策略在提高非特异性过氧化酶分泌效率及酶活中的应用。

13、本发明至少具有以下优点：本发明以毕赤酵母gs115为出发菌，通过易错pcr文库构建、构建高拷贝菌株和共表达分子伴侣蛋白，实现pada-i的高效分泌，底物为甲醇，发酵成本低，分离纯化过程简单，在制备pada-i中具有潜力。

技术特征：

1.一种高效表达非特异性过氧化酶毕赤酵母重组菌株的构建方法，其特征在于包括以下步骤：

2.如权利要求1所述的一种高效表达非特异性过氧化酶毕赤酵母重组菌株的构建方法，其特征在于所述线性化质粒为ppiczαa-pada-i，所述质粒载体为ppiczαa。

3.如权利要求1所述的一种高效表达非特异性过氧化酶毕赤酵母重组菌株的构建方法，其特征在于所述毕赤酵母为毕赤酵母gs115。

4.如权利要求1所述的一种高效表达非特异性过氧化酶毕赤酵母重组菌株的构建方法，其特征在于所述分子伴侣包括hac1、pdi和ero1。

5.权利要求1-4任一项所述的方法制备的高效表达非特异性过氧化酶毕赤酵母重组菌株。

6.信号肽优化和伴侣共表达优化的组合策略在提高非特异性过氧化酶分泌效率及酶活中的应用。

技术总结
一种高效表达非特异性过氧化酶毕赤酵母重组菌株的构建方法，属于基因工程技术领域。其包括以下步骤：1)构建质粒；2)易错PCR突变体库构建；3)高拷贝菌株的构建；4)共表达分子伴侣。本发明至少具有以下优点：本发明以毕赤酵母GS115为出发菌，通过易错PCR文库构建、构建高拷贝菌株和共表达分子伴侣蛋白，实现PaDa‑I的高效分泌，底物为甲醇，发酵成本低，分离纯化过程简单，在制备PaDa‑I中具有潜力。

技术研发人员：柳志强,沈秀红,柯霞,郑彤,郑裕国
受保护的技术使用者：浙江工业大学
技术研发日：
技术公布日：2024/5/6