一种靶向FLT-3的第四代嵌合抗原受体及其应用的制作方法

本发明涉及核酸检测，特别涉及一种靶向flt-3的第四代嵌合抗原受体及其应用。

背景技术：

1、急性髓细胞性白血病(acute myeloid leukemia，aml)是髓系造血干/祖细胞恶性疾病，以骨髓与外周血中原始和幼稚髓性细胞异常增生为主要特征，为白血病细胞克隆性增殖失控、凋亡障碍及分化受阻，白血病细胞在骨髓累积，并且浸润其他组织、器官造成正常造血功能受到抑制及器官功能障碍，引起贫血、出血、感染和发热、髓外浸润、代谢异常等临床表现的一种血液系统恶性疾病。aml常见于老年人，由于存在高龄、合并症多、不良染色体核型多、前驱血液系统疾病等不利预后因素，老年患者的长期存活率仍很低，5年生存率仅5％～10％。大约一半的aml患者在接受治疗后会复发。患者的预后和生活质量会随着复发而下降，后续治疗选择十分有限。近年来出现不少aml的治疗新药，这类新药为一些复发难治aml患者带来再次获得缓解的机会。即便如此，复发难治白血病的疗效依然欠佳。

2、aml耐药机制错综复杂，多项研究结果表明，aml耐药不仅与aml细胞自身的生物学特征相关，骨髓微环境亦在aml发生、发展、复发及耐药中，发挥重要作用。骨髓微环境又称骨髓龛，于1978年由schofield首次提出。骨髓微环境由成纤维样细胞、基质细胞、成骨细胞及破骨细胞及细胞外基质和细胞因子等成分组成，骨髓微环境是aml细胞逃避化疗及靶向药物杀伤作用的“庇护所”。骨髓基质细胞，也称为骨髓间充质干细胞(mesenchymal stemcell，msc)，是骨髓微环境的重要组成，其不仅维持正常骨髓造血功能，而且保护aml细胞免受化疗药物杀伤，并且促进白血病干细胞(leukemia stem cell，lsc)存活，骨髓微环境中aml细胞逃逸化疗药物杀伤为aml耐药的重要原因之一。此外，骨髓微环境中msc也可以通过分泌可溶性细胞因子、细胞黏附及促进lsc的自我更新及分化，介导aml耐药。

技术实现思路

1、本发明目的在于公开了一种靶向flt-3的第四代嵌合抗原受体(chimericantigen receptor，car)及其应用，以解决现有技术中所存在的一个或多个技术问题，提供至少一种有益的选择或创造条件。

2、为实现上述目的，本发明通过以下技术方案实现：

3、本发明第一方面在于提供一种靶向flt-3的嵌合抗原受体。

4、本发明第二方面在于提供含有上述嵌合抗原受体的转移载体。

5、本发明第三方面在于提供所述转移载体的制备方法。

6、本发明第四方面在于提供一种含有上述嵌合抗原受体或由所述转移载体制得的重组慢病毒。

7、本发明第五方面在于提供所述重组慢病毒的制备方法。

8、本发明第六方面在于提供一种嵌合抗原受体t(car-t)细胞。

9、本发明第一方面所述的靶向flt-3的嵌合抗原受体包括抗原结合区和细胞因子表达区，所述抗原结合区为flt-3配体，所述细细胞因子表达区包括il-7和il-24。

10、msc可以通过分泌cxc基序趋化因子配体(cxc motif chemokine ligand，cxcl)12，cxcl12通过与受体cxc基序趋化因子受体4(cxc motif chemokine receptor，cxcr)相互作用，促进造血干细胞(hematopoietic stem cell，hsc)的归巢与骨髓微环境的稳定。cxcr4在aml患者中过表达，与其预后不良相关。而且目前已有研究结果证实，化疗药物可以上调aml患者的cxcr4表达水平，导致患者对化疗耐药，而cxcr4抑制剂能够增加aml细胞对化疗药物的敏感性。所述靶嵌合抗原受体由于具有flt-3配体的抗原结合区以及编码il-7和il-24的细胞因子表达区，能够使得组装有所述嵌合抗原受体的car-t细胞与靶抗原结合并协同il-7和il-24的分泌。所述car-t细胞分泌的il-7和il-24具有协同治疗作用：(1)能够抑制aml的肿瘤微环境中的耐药性，协助提高化疗疗效；(2)抑制肿瘤微环境中的aml肿瘤细胞的增殖、侵袭、转移，避免肿瘤复发。

11、flt-3是一种酪氨酸激酶受体，具有细胞外区域、近膜结构域(jm)和酪氨酸激酶结构域(tkd)。flt-3受体的突变会通过自磷酸化导致激酶的结构性激活以及多个下游信号通路的激活，这会导致细胞快速增殖并减少细胞凋亡。aml患者中已经发现了两种不同的flt3突变：第一种是在jm中发现的内部串联重复(itd)突变，被称为flt3-itd突变；第二种是tkd内的错义点突变，被称为flt3-tkd突变。其中flt3-itd被证明与aml患者的快速复发和较短的总生存期相关，特别是在那些等位基因负担较高的患者中。但现有技术中使用单链可变片段(scfv)作为car识别域靶向flt3的car-t细胞未能从突变的flt-3中识别出野生型flt-3。

12、在本发明第一方面的一些实施方式中，编码所述flt-3配体的核苷酸序列如seqid no.1所示。seq id no.1所示的flt-3配体序列片段能够令组装有所述嵌合抗原受体的car-t细胞识别flt-3野生型细胞和突变细胞，最终针对flt-3阳性的细胞发挥特异性杀伤作用。

13、在本发明第一方面的一些实施方式中，所述细胞因子表达区的结构为p2a—il-7—t2a—il-24。所述细胞因子表达区中编码il-7和il-24的片段通过自剪切2a肽连接，使得car-t细胞表达的il-7和il-24能够释放至胞外并产生促进治疗aml的协同作用。

14、在本发明第一方面的一些实施方式中，编码所述细胞因子表达区的核苷酸序列如seq id no.3所示，其5’端和3’端分别添加了酶切位点ndei和mlui，以便于合成长度较大的所述嵌合抗原受体核苷酸序列。

15、在本发明第一方面的一些实施方式中，所述嵌合抗原受体还包括cd8α前导肽、cd8铰链区、cd28跨膜区和共刺激区，所述共刺激区由cd28胞内片段与cd3ζ胞内信号传导结构域串联组成。

16、在本发明第一方面的一些实施方式中，所述嵌合抗原受体的核苷酸序列如seq idno.10所示。

17、本发明第二方面所述转移质粒中含有如本发明第一方面所述嵌合抗原受体片段。所述转移质粒可用于扩增所述嵌合抗原受体或构建重组慢病毒。

18、本发明第三方面所述转移质粒的制备方法包括以下步骤：

19、(1)通过合成或重叠pcr反应的方法获取所述嵌合抗原受体；

20、(2)将所述嵌合抗原受体与线性化的载体质粒连接，获得所述转移质粒。

21、本发明第四方面所述重组慢病毒的包装细胞内含有如本发明第一方面所述嵌合抗原受体片段。

22、在本发明第四方面的一些实施方式中，所述包装细胞为hek293t。

23、本发明第五方面所述重组慢病毒的制备方法包括以下步骤：

24、(a)获取含有如本发明第一方面所述嵌合抗原受体片段的转移质粒；

25、(b)使用pei转染试剂将包膜质粒、包装质粒以及如本发明第二方面所述转移质粒混合，获得转染mix；

26、(c)将包装细胞加入所述转染mix中进行质粒共转染，分离纯化后获得所述重组慢病毒。

27、本发明第六方面所述嵌合抗原受体t细胞是由本发明第四方面所述重组慢病毒对t淋巴细胞进行慢病毒转染获得。所述嵌合抗原受体t细胞经验证能够在体外能够实现582倍的扩增，且15日细胞活率在90％以上，具有良好的商品化能力。同时，所述嵌合抗原受体t细胞能够对高表达flt3的aml3细胞株，molm-13细胞株和mv-4-11细胞株有明显的杀伤作用，而对不表达flt-3的raji细胞株和meg-01细胞株不具备明显的杀伤作用，证明所述嵌合抗原受体t细胞能特异性的杀伤flt-3高表达的髓性白血病肿瘤细胞株。