一种尼麦角林的生物限度检验方法与流程

本发明涉及微生物限度领域，特别是涉及一种尼麦角林的生物限度检验方法。

背景技术：

1、尼麦角林为白色至微黄色结晶性粉末或颗粒。在甲醇中极易溶解，在乙睛或乙醇中溶解，在水中几乎不溶。化学名称：(8β)-10-甲氧基-1,6-二甲基尼麦角林-8-甲醇基-5-溴-3-吡啶羧酸酯，分子式：c24h26brn3o3，分子量：484.39，为半合成麦角碱衍生物。。

2、目前，行业中尼麦角林微生物限度检查的检验方法一般为：采用取尼麦角林5g转移至250ml含5％聚山梨酯80的ph为7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液中，振摇混匀，作为1:50供试液，分别取1：50供试液1ml，加入到100ml ph为7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液中，薄膜过滤，每次用100ml ph为7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液冲洗滤膜，共冲洗8次，在最后一次冲洗液中加入1ml(含菌量≤100cfu/ml)金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、黑曲霉、白色念珠菌试验菌菌悬液过滤，金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌。但是，经申请人大量研究发现，现有的尼麦角林的微生物检测方法存在检测结果不准确的问题，因此需要一种尼麦角林微生物检验方法，能够快速准确有效的检验尼麦角林样品中的微生物。

技术实现思路

1、申请人在研究时发现，尼麦角林具有一定的抑菌作用，该抑菌作用可能会导致使用上述限度检测方法时，滤膜上残留的微量药物抑制阳性菌生长，从而导致检测误差；另外，由于尼麦角林不溶于水，其溶解性也可能会影响微生物限度检测的准确性。

2、为了解决上述及其他原因导致的检验方法不准确的问题，本发明采用的技术方案是：提供一种尼麦角林微生物限度检验方法，所述微生物限度检验方法包括以下步骤：

3、(1)取尼麦角林加入溶液a中，制成质量与体积比为0.01～0.05的溶液，优选为0.02的供试液；

4、(2)取步骤(1)供试液进一步用溶液b进行混合，制成质量与体积比为0.01～0.05的溶液，优选为0.01～0.02的供试液；

5、(3)采用薄膜过滤法，将经步骤(2)的供试液过滤；

6、(4)将过滤后的滤膜进行微生物培养；

7、所述方法中检查项目包括：a.需氧菌总数计数、b.霉菌和酵母菌总数计数、c.控制菌中的一种或多种的混合；

8、本发明中，步骤(1)中所述溶液a包括：缓冲溶液；进一步地，所述缓冲溶液氯化钠-蛋白胨缓冲液；

9、本发明中，步骤(2)中所述溶液b包括：中和剂溶液。

10、在发明中，所述中和剂溶液包括聚山梨酯80、氯化钠-蛋白胨缓冲液、氯化钙溶液、甘氨酸溶液、水中的一种或多种的混合物；在某些实施方案中，所述中和剂溶液由聚山梨酯80、氯化钠-蛋白胨缓冲液、氯化钙溶液、甘氨酸溶液、水中的一种或几种组成；在某些实施方案中，所述中和剂溶液由聚山梨酯80、氯化钠-蛋白胨缓冲液、氯化钙溶液、甘氨酸溶液组成；

11、当所述质量的单位为g时，所述体积的单位为ml。

12、本发明中，所述尼麦角林包括其原料、制剂。

13、本发明中，所述中和剂溶液包括：含1％～20％聚山梨酯80的氯化钠-蛋白胨缓冲液、1％～20％氯化钙溶液、5％～25％甘氨酸溶液。

14、进一步地，所述氯化钙溶液浓度选自5％～10％，例如可以选自5％、6％、7％、8％、9％、10％等等。

15、进一步地，所述氯化钙溶液浓度选自5％、10％，且当氯化钙溶液浓度选自10％时，滤膜冲洗次数至少为8次。

16、更进一步地，所述氯化钙溶液浓度为5％。

17、作为本发明优选实施方式，所述中和剂溶液包括：含5％聚山梨酯80的氯化钠-蛋白胨缓冲液、5％氯化钙溶液、10％甘氨酸溶液。

18、作为本发明优选实施方式，所述中和剂溶液包括：含5％聚山梨酯80的氯化钠-蛋白胨缓冲液、10％氯化钙溶液、10％甘氨酸溶液。

19、本发明中，所述中和剂溶液中，氯化钠-蛋白胨缓冲液：氯化钙溶液：甘氨酸溶液的体积比为1:1:1。

20、本发明中，微生物检查包括如下步骤：取步骤(2)制得的供试液，加入氯化钠-蛋白胨缓冲液中，薄膜过滤后，用冲洗剂冲洗滤膜，滤干后取出滤膜正放于培养基上进行培养，并检测结果。

21、作为本发明优选的实施方式，所述冲洗剂为ph为7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液。

22、所述ph7.0无菌氯化钠-蛋白胨溶液按照《2015中国药典》微生物限度检查法项下方法配制。

23、本发明中，冲洗滤膜的冲洗量每次约100ml，总量不超过1000ml。

24、本发明中，滤膜冲洗次数不超过10次。

25、作为本发明某些具体优选的实施方式，滤膜冲洗次数为5～10次，所述冲洗次数更优选5次。通过大量的研究与验证，申请人发现，本发明实施方案中，冲洗次数5～10次可以利于本发明效果的获得；申请人还发现当冲洗次数较多时(例如8次以上)，培养得到的菌种有时产生形态扩散、蔓延成片，检验结果可以符合规定，但检验计数存在一定困难，对于计数的效率与便捷程度都产生一定影响；申请人发现，本发明某些优选实施方案中，冲洗次数为5次时，菌种形态适宜、计数方便清晰，能够快速准确得获得检验结果。

26、本发明中，需氧菌包括：金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、黑曲霉和白色念珠菌；霉菌和酵母菌包括黑曲霉、白色念珠菌。

27、进一步地，需氧菌为金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌或枯草芽孢杆菌时，培养时间不超过3天；需氧菌为白色念珠菌或黑曲霉菌时，培养时间不超过5天。

28、本发明的实施方案[例如包含5％聚山梨酯80的ph为7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液、5％～10％无菌氯化钙溶液(例如5％或10％的无菌氯化钙溶液)、10％无菌甘氨酸溶液配制的中和剂，加入例如是缓冲溶液氯化钠-蛋白胨缓冲液中，配制成本发明中某些比例(例如0.01～0.05)，再以冲洗剂冲洗一定次数(例如不超过10次，可选的5～10次，具体为5～8次，优选5次)]，各项微生物回收率能够符合可接受标准ktsa∈(0.5，2)、ksda∈(0.5，2)、wtsa∈(0.5，2)、wsda∈(0.5，2)，本发明的方法适用于尼麦角林微生物限度检查。

29、本发明的有益效果是：

30、(1)本发明提供的尼麦角林微生物计数检查方法，采用薄膜过滤法进行需氧菌总数及霉菌和酵母菌总数的计数方法，各菌株回收比均符合规定；

31、(2)本发明中尼麦角林微生物检查方法科学合理，操作简单，试验结果准确、稳定，重现性好，可进行供试品需氧菌总数及霉菌和酵母菌总数计数，适用于尼麦角林的微生物限度检查以及计数方法的适用性试验和方法学验证；

32、(3)在不减少样品数量，且不增加冲洗量的基础上，仍能有效进行尼麦角林的微生物限度检查，所用试剂成本较低，降低了企业的检测成本；本发明某些优选实施方案不仅微生物检验结果准确，方案中冲洗剂用量及次数都更少，更符合微生物检验标准，能够获得形态更适宜、计数更方便的目标菌种，利于快速并准确地得到检验结果。