一种高效的肌醇-1-磷酸合成酶及其突变体的制作方法

本发明属于基因工程和生物催化领域，具体涉及一种用于生产肌醇的大肠杆菌工程菌的构建方式及其在具体催化中的应用。

背景技术：

1、肌醇(inositol)，又名环己六醇，具有如下所示的结构：

2、

3、肌醇是广泛分布在动物和植物体内，是动物、微生物的生长因子。最早从心肌和肝脏中分离得到。肌醇在自然界存在有多个顺、反异构体，最常见的是肌肉肌醇(myo-inositol)。

4、肌醇是人、动物与微生物生长的必需物质，广泛应用于医药、食品、饲料等行业。目前全球的需求量大概在每年5,000吨左右，由于目前肌醇的高售价，使得肌醇的市场前景还未得到充分的开发，例如2013年全球饲料产量为9.6亿吨，如果都加入0.2-0.5％的肌醇，那么饲料工业所需肌醇的产量应该达到每年190-480万吨。在这种情况下，目前中国国内，甚至全世界的产量都远远不能满足需求。

5、几乎所有生物都含有游离态或结合态的肌醇。在植物和鸟类有核红血球中作为六磷酸肌醇是以六磷酸酯形式存在的。较此化合物磷酸基数目少的化合物同样分布在植物和动物中，另外游离态的肌醇主要存在于肌肉、心脏、肺脏、肝脏中，是磷脂的一种磷脂酰肌醇的组成成分。

6、肌肉肌醇是鸟类、哺乳类的必需营养源，缺乏肌肉肌醇，例如小鼠可引起脱毛、大鼠可引起眼周围异常等症状。大鼠可大量代谢肌醇，但尿中排量并不多。鲨鱼似乎能把肌醇转变成为一种贮藏能量的物质。是生命素i的成分之一。

7、肌醇的生产方法主要有传统生产方法、植酸钠水解法、常压催化法、化学合成法、酶催化法。

8、传统生产方法为加压水解法。由于加压水解法具有多年的工业化生产实践经验，是国内生产厂家采用的主要工艺技术。加压水解法一般流程：菲汀(水解)→水解液(中和、过滤)→肌醇液(除杂浓缩、结晶离心)→粗肌醇(溶解除杂、结晶离心)→精品。操作繁琐，收率低，不适合工业大规模生产。

9、植酸钠水解法是吉林化工学院开发了以玉米浸渍水为原料，用离子交换树脂吸附法生产植酸钠，再进行加压水解反应生产肌醇的新工艺。新工艺生产肌醇的同时，联产磷酸氢二钠(磷酸氢二钠产量为肌醇产量的12倍左右)，有效地回收了谷物中的有机磷，为农副产品中有机磷的回收开辟了新的途径。生产工艺简述：玉米浸渍水经离子交换树脂吸附法得到一定浓度的植酸钠溶液，进行加压水解反应，生成肌醇和磷酸氢二钠。反应一定时间后，出料、过滤、冷却、结晶，析出磷酸氢二钠晶体。将析出磷酸氢二钠晶体的水解反应液依次通过阴、阳离子交换树脂，反复进行精制，直到水解反应液中阴、阳离子浓度达到规定的标准为止。精制后的水解反应液经浓缩、结晶，即可得成品肌醇。此方法肌醇收率低，成本高，不适合进行工业化生产。

10、常压催化法是近几年我国新近研制并投入工业化生产的一种生产肌醇的新方法，其水解和精制有独特之处。生产工艺：在一定浓度的菲汀溶液中常压下加入一定比例的催化剂(由甘油与尿素、碳酸钙复合配制而成)，加热水解，经水解、过滤、结晶、烘干等工序，即可得到肌醇。因催化剂自身特性，肌醇可一次性结晶，而获得较高质量的成品，从而简化了工序。催化剂可循环使用。此方法水解温度高，带有一定危险性。

11、化学合成法以葡萄糖为原料生产肌醇的方法：用葡萄糖作原料，在反应釜中加入乙醇和硼酸进行络合反应，络合反应结束时将乙醇回收再用；络合的原液送入已加有亚硝酸钠和冰醋酸的反应釜中氧化、再经开环和关环处理、水解中和，然后加入硫酸铜沉淀、酸化中和；送入过滤机过滤(滤渣做肥料)后的滤液进入结晶釜中浓缩结晶；最后经蒸馏水解除杂、加入活性炭脱色、二次浓缩结晶、脱水分离(母液回收)、烘干粉碎得成品。此方法收率低、操作过程中添加乙醇以及硼酸，带有一定的危险性。

12、酶催化法的研究中，2017年天津工业生物技术研技术所的游淳设计了5个酶参与的由淀粉到肌醇的酶催化反应，产物浓度做到95g/l，产物通过乙醇结晶纯化得到，由于最后两个酶反应是不可逆反应，所以该酶催化体系能够得到很高的转化率。上述工艺的专利号为cn106148425b。

13、发酵法生产肌醇的研究中，北京化工大学袁其朋课题组对e.coli进行了改造，利用甘油供细胞生长，利用葡萄糖供肌醇合成，过表达j23100-glpk(psc101 ori，chen z,etal,2017)，发酵96h，产物达到76g/l。中国科学院的陶勇团队利用与袁其朋课题组类似的思路构建了生产菌株，菌株生长24h，生物转化20h的产物浓度106.3g/l。山东福洋生物科技有限公司的专利cn113957101a“一种重组大肠杆菌发酵生产肌醇的方法”，显示其已达到发酵液中产肌醇浓度110-130g/l，葡萄糖转化成肌醇，转化率达到70％，结晶出肌醇成品，收率70％。

14、肌醇-1-磷酸是合成肌醇的重要前体物质，故而开发高效的肌醇-1-磷酸的制备方法具有重要意义，以葡萄糖-6-磷酸为底物合成肌醇-1-磷酸所用相关酶的报道较少，最常用的为酿酒酵母来源的ino1，探究更多来源的新酶，是本专利的创新方向。

技术实现思路

1、本发明针对现有酶研究的局限性，从不同来源的酶出发，筛选获得初始活性较好的酶，并对其进行酶工程的定向进化，获得对底物葡萄糖-6-磷酸活性更高，亲和力更好的肌醇-1-磷酸合成酶。

2、本发明提供多种肌醇-1-磷酸合成酶，所述酶具有如seq id no.1、3、5或7所示的氨基酸序列。

3、本发明提供一种编码上述酶的多核苷酸，所述多核苷酸具有如seq idno.2、4、6或8所述的核苷酸序列。

4、本发明提供一种载体，其包含如上所述的多核苷酸。

5、优选的，所述载体是大肠杆菌表达质粒。

6、本发明提供一种宿主细胞，所述宿主细胞包含如上所述的肌醇-1-磷酸合成酶，或者包含如上所述的多核苷酸或载体。

7、优选的，所述宿主细胞不具有代谢和降解葡萄糖-6-磷酸的功能。

8、优选的，所述宿主细胞为大肠杆菌细胞。

9、所述宿主细胞具有相较于野生型更强的肌醇单磷酸酶表达量。

10、肌醇单磷酸酶存在于宿主细胞中，能够将肌醇-1-磷酸水解成肌醇。

11、本发明提供一种高效转化葡萄糖-6-磷酸生成肌醇的方法，所述方法为在上述宿主细胞中过表达seq id no.1，3，5或7的酶或者与seq id no.1同源性大于等于99％的突变体。

12、另一方面，本发明还提供一种高效转化葡萄糖-6-磷酸生成肌醇的方法，所述方法包括为以葡萄糖-6-磷酸为底物，添加seq id no.1，3，5或7的酶或者与seq id no.1同源性大于等于99％的突变体。

13、优选的，上述方法包括进一步添加肌醇单磷酸酶。

技术特征：

1.一种肌醇-1-磷酸合成酶，所述酶具有如seq id no.1、3、5或7所示的氨基酸序列。

2.一种编码如权利要求1所述的酶的多核苷酸，所述多核苷酸具有如seq id no.2、4、6或8所述的核苷酸序列。

3.一种载体，其特征在于，包含如权利要求2所述的多核苷酸。

4.如权利要求3所述的载体，其特征在于，所述载体是大肠杆菌表达质粒。

5.一种宿主细胞，所述宿主细胞包含如权利要求1所述的肌醇-1-磷酸合成酶，或者包含如权利要求2所述的多核苷酸或权利要求3所述的载体。

6.如权利要求5所述的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞不具有代谢和降解葡萄糖-6-磷酸的功能。

7.如权利要求5或6所述的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞为大肠杆菌细胞。

8.如权利要求5-7任一项所述的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞具有相较于野生型更强的肌醇单磷酸酶表达量。

9.一种高效转化葡萄糖-6-磷酸生成肌醇的方法，所述方法为在权利要求5-7任一项所述的宿主细胞中过表达seq id no.1，3，5或7的酶或者与seq idno.1同源性大于等于99％的突变体。

10.一种高效转化葡萄糖-6-磷酸生成肌醇的方法，所述方法包括为以葡萄糖-6-磷酸为底物，添加seq id no.1，3，5或7的酶或者与seq id no.1同源性大于等于99％的突变体的步骤。

技术总结
本发明提供一种肌醇‑1‑磷酸合成酶，所述蛋白具有如SEQ ID No.1、3、5、7所述的氨基酸序列，本发明还提供一种改造肌醇生产细菌实现高产的方法，其特征在于，在肌醇生产细菌宿主中过表达SEQ ID No.1、3、5、7所述的关键酶。

技术研发人员：谢新开,范俊英,陈耕,谷娜
受保护的技术使用者：苏州引航生物科技有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/4/8