一种磷脂酶D突变体及其制备方法、应用和磷脂酰丝氨酸的制备方法与流程

本发明属于蛋白改造，涉及一种磷脂酶d突变体及其制备方法、应用和磷脂酰丝氨酸的制备方法。

背景技术：

1、磷脂酰丝氨酸(phosphatidylserine，简称ps)又称丝氨酸磷脂、二酰甘油酰磷酸丝氨酸，是一类普遍存在的磷脂，通常位于细胞膜的内层，磷脂化学物中的磷酸甘油酯类，是细胞膜组分之一，与一系列的膜功能有关。尤其在人体的神经系统，是大脑的细胞膜的重要组成成分之一，同时对大脑的各种功能(尤其是对大脑的记忆力和情绪的稳定)起到重要的调节作用，如它能影响着细胞膜的流动性、通透性，并且能激活多种酶类的代谢和合成。具有重要的功能与作用，例如延缓衰老、维持机体健康年轻、强化脑部功能、增强记忆力、治疗多动症儿童、促进血液循环、分解过高的血脂和过高的胆固醇、清扫血管，使血管顺畅，从而减轻脂肪肝的发病率，有“血管清道夫”的美誉。

2、目前工业化生产磷脂酰丝氨酸的制备方法主要有提取法和酶转化法，其中提取法主要是从植物细胞、动物的卵磷脂中提取ps，植物中的ps含量较少，所以提取法以动物的卵磷脂中提取为主，从动物中提取主要是动物的大脑及内脏，目前国外大部分以牛、羊、兔、马、驴等家禽的动物脑为原料来提取ps。近年来，由于疯牛病的等动物疾病的原因，利用动物细胞提取ps的方法，其提取的产品的安全性受到人们的怀疑，现在已处于淘汰边缘。

3、酶转化法主要是以天然的卵磷脂为基质，加入丝氨酸，利用磷脂酶d(phospholipase d，英文简称pld)，在双相体系(水相-有机相)或纯水相体系催化生成磷脂酰丝氨酸，然而，磷脂酶d的低表达水平仍然是其在工业应用上的障碍，因此，开发更高酶活的磷脂酶d是本领域的研究重点。

技术实现思路

1、针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种磷脂酶d突变体及其制备方法、应用和磷脂酰丝氨酸的制备方法。本发明的种磷脂酶d突变体转磷脂酰基催化活力能力提高，从而提高催化合成磷脂酰丝氨酸的反应速率，大大降低生产成本，实现磷脂酶d在工业上的应用，提高磷脂酰丝氨酸的产量和收率。

2、为达此目的，本发明采用以下技术方案：

3、第一方面，本发明提供一种磷脂酶d突变体，所述磷脂酶d突变体为在seq id no.1所示的氨基酸序列的基础上发生了氨基酸突变的磷脂酶d；

4、所述氨基酸突变的类型包括l87e、g379q、l461d中的任意一种或至少两种的组合。

5、本发明中，通过在磷脂酶d中引入上述突变，显著提高了磷脂酰转移活性，相比于原始的磷脂酶d，所述磷脂酶d突变体的相对酶活可高达400％，使得磷脂酰丝氨酸在温和的反应条件生成，降低了生产成本以及生产的难度，提高了生产效率，具有实际应用的价值。

6、在本发明中，seq id no.1所示的氨基酸序列如下：

7、apsptphldsieqtlrqvspglegsvwertsgnrlgsstpggadwllqtpgcwgdaactdrpgsrrlldkmrqdvaaaretvdistlapfpnggyqdaivaglkesvqkgnrlkvrimvgaapvyhstvipssyrdellaklgpaaaaditlnvasmttsktsfswnhsklivvdgssvitgginswkddyldtthpvadvdlalsgpaagsagryldtlwdwtcrnksswssvwfaaspgadcmpslprpaspagggdvpalavgglgvgirqndpasafrpvlptardtkcgiglpdrtnadrdydtvnpeesalralvagatshieisqqdihatcpplprydvrlydalaaklvsgvkvrivvsdpanrgtigsggysqitslnevsdalrgrvaaltgdgarartamcenlqlatfrasdrptwadgkpyaqhhklvsvdgsafyigsknlypswlqdfgyivespaaagqlksdlldpqwrysqatatydytrglcqg。

8、优选地，所述磷脂酶d突变体为l87e、g379q、l461d、l87e/g379q、g379q/l461d、l87e/l461d或l87e/g379q/l461d。

9、在本发明中，所述l87e/g379q突变体代表在seq id no.1所示的氨基酸序列基础上发生了87位和379位氨基酸突变得到的突变体，g379q/l461d、l87e/l461d或l87e/g379q/l461d具有相似的含义，不再赘述。

10、优选地，所述磷脂酶d的编码序列包括seq id no.2所示的核苷酸序列。

11、seq id no.2：

12、gctccatctccaactccacatttggactccatcgagcaaaccctgagacaagtttccccaggattggaaggttccgtttgggaaagaacctccggtaacagactgggttcttctactccaggaggagcagattggttgttgcaaactccaggttgttggggagacgcagcttgtacagatagaccaggttccagaagactgctggataagatgagacaggacgttgcagcagctagagaaaccgttgacatctccactttggctccattcccaaacggaggttaccaagacgctatcgttgccggtttgaaggaatccgttcagaagggtaacagactgaaggtcagaatcatggtcggagcagctccagtttaccattctaccgttatcccatcctcctacagagacgagttgttggctaagttaggtccagcagcagcagcagatatcactttgaacgtcgcttccatgaccacctcaaagacctccttctcttggaaccactccaagctgatcgttgttgacggttcctccgttatcaccggaggtatcaactcttggaaggacgactacttggacactactcatccagttgccgacgttgatttggctttgtcaggaccagctgctggttcagcaggtagatacttggataccctttgggattggacttgcagaaacaagtcctcttggtcctccgtttggtttgcagcttctccaggagcagattgtatgccatctttgccaagaccagcttcaccagcaggaggaggagacgttcctgctttagcagttggaggtttgggagttggtatcagacagaacgatccagcttccgctttcagaccagttttgccaaccgctagagacactaagtgcggtatcggtttgccagatagaactaacgccgacagagactacgataccgttaacccagaggagtcagctttgagagctttggttgcaggagctacttcccacattgaaatttctcagcaagacatccacgctacttgtccaccattgccaagatacgacgtcagattgtacgacgctttggcagctaagttggtttccggtgtcaaggtcagaatcgttgtttccgacccagctaacagaggtactattggttccggaggttactcccagatcacttccttgaacgaggtttccgacgctttgagaggtagagttgcagcattgacaggagacggagctagagctagaacagctatgtgcgagaacttgcagttggctaccttcagagcttccgatagaccaacttgggctgacggtaaaccatacgctcaacatcacaagttggtctccgttgacggttcagctttctacatcggttccaagaacctgtacccatcttggttgcaggacttcggttacatcgtcgaatctccagcagcagcaggtcaattgaagtctgatttgcttgaccctcagtggagatactctcaagctacagctacctacgactacaccagaggactttgccaaggttag。

13、优选地，所述磷脂酶d突变体与磷脂酶d的同源性在80％以上，例如可以是80％、85％、90％或95％等，该数值范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。

14、优选地，所述磷脂酶d来源于链霉菌(streptomyces sp.)。

15、第二方面，本发明提供了一种核酸分子，所述核酸分子编码第一方面所述的磷脂酶d突变体。

16、第三方面，本发明提供了一种表达载体，所述表达载体含有至少一个拷贝的第二方面所述的核酸分子。

17、第四方面，本发明提供了一种磷脂酶d突变体转化子，所述磷脂酶d突变体转化子为表达第一方面所述的磷脂酶d突变体的基因工程菌株。

18、优选地，所述磷脂酶d突变体转化子含有第二方面所述的核酸分子。

19、优选地，所述磷脂酶d突变体转化子含有第三方面所述的表达载体。

20、优选地，所述基因工程菌株包括大肠杆菌、毕氏酵母或枯草芽孢杆菌中的任意一种。

21、第五方面，本发明提供了一种第一方面所述的磷脂酶d突变体的制备方法，所述制备方法包括：

22、构建表达载体，转化至受体细胞中，构建磷脂酶d突变体转化子；培养所述磷脂酶d突变体转化子，收集培养物，得到所述磷脂酶d突变体。

23、在本发明中，所述构建表达载体包括以下步骤：

24、利用分子建模技术预测出可能与催化和底物结合有关的位点为第87、379和461这三个位点，随后以pld-ppic9k重组质粒为模板，对3个位点进行定点突变，获得包含l87e、g379q、l461d中的任意一种或至少两种的组合的突变体。

25、优选地，l87e突变的正向引物的核苷酸序列如seq id no.3所示：5'gttgacatctccactgaggctccattcccaaac3'，反向引物的核苷酸序列如seq id no.4所示：5'gtttgggaatggagcctcagtggagatgtcaac 3'。

26、优选地，g379q突变的正向引物的核苷酸序列如seq id no.5所示：5'gaggtactattggttcccaaggttactcccagatc3'，反向引物的核苷酸序列如seq id no.6所示：5'gatctgggagtaaccttgggaaccaatagtacctc3'。

27、优选地，l461d突变的正向引物的核苷酸序列如seq id no.7所示：5'cctgtacccatcttgggaccaggacttcggttac3'，反向引物的核苷酸序列如seq id no.8所示：5'gtaaccgaagtcctggtcccaagatgggtacagg3'。

28、第六方面，本发明提供了一种第一方面所述的磷脂酶d突变体在催化合成磷脂酰丝氨酸反应中的应用。

29、第七方面，本发明提供一种磷脂酰丝氨酸的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：将磷脂酶d突变体添加至含有大豆卵磷脂和l-丝氨酸的反应体系中反应，获得含磷脂酰丝氨酸的反应液；将含磷脂酰丝氨酸的反应液进行提取，获得磷脂酰丝氨酸。

30、优选地，所述大豆卵磷脂和l-丝氨酸的质量比为1:2-1:10，例如1:2、1:2.5、1:3、1:3.5、1:4、1:4.5、1:5、1:5.5、1:6、1:6.5、1:7、1:7.5、1:8、1:8.5、1:9、1:9.5或1:10。

31、优选地，所述磷脂酶d突变体的用量为大豆卵磷脂重量的5-10％；例如5％、5.5％、6％、6.5％、7％、7.5％、8％、8.5％、9％、9.5％或10％。

32、优选地，所述反应体系的ph为5.0-6.0，例如5.0、5.2、5.4、5.6、5.8或6.0。

33、优选地，所述反应的温度为35-45℃，例如35℃、37℃、39℃、40℃、42℃、44℃或45℃，反应时间为12-24h，例如12h、14h、16h、18h、20h、22h或24h。

34、相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：

35、本发明的种磷脂酶d突变体转磷脂酰基催化活力能力提高，从而提高了磷脂酰丝氨酸制备的反应速率，大大降低生产成本，实现磷脂酶d在工业上的应用，提高磷脂酰丝氨酸的产量和收率。