三种孢子蛋白融合稳定展示猪腹泻病毒三种关键抗原重组枯草芽孢杆菌及其构建方法和应用

本发明属于基因工程，具体涉及三种孢子蛋白融合稳定展示猪腹泻病毒三种关键抗原重组枯草芽孢杆菌及其构建方法和应用。

背景技术：

1、枯草芽孢杆菌是一种广泛存在于自然环境中的革兰氏阳性细菌，呈不规则的簇或株状生长，形态为杆状。它的细胞壁结构中含有多糖、肽聚糖及其交联物，其糖基组成中含有软骨素(glucosamine)、甘露糖(mannose)、n-乙酰葡萄糖(n-acetylglucosamine)等成分。这些糖基及其交联结构赋予了细胞壁较好的韧性和稳定性，使得其在较恶劣环境下生存和繁殖。枯草杆菌孢子表面展示是指通过与孢子外壳蛋白(锚定基序)融合，在孢子表面表达所需的酶或抗原(靶蛋白)，已被证明是疫苗开发、酶固定化以及抗癌药物和人类相关蛋白输送等领域的有力工具。枯草杆菌孢子表面展示具有天然优势，包括高安全性、出色的稳定性和独特的展示多种生物分子的能力，如抗原、四聚体酶和蛋白质。

2、国内外已经对枯草芽孢杆菌研究了一百多年。多种芽孢衣壳蛋白如cotb、cotc、cotg和cotx已成功应用于分子载体，这为开发新的应用提供了潜在的机会。这些靶蛋白包括破伤风毒素片段c(ttfc)、链霉素、绿色荧光蛋(gfp)、单链抗体、植酸酶、b-半乳糖苷酶、x-氨基转移酶和其他酶等均成功展示在芽孢表面。2001年，medaglini等人报道了第一次成功使用cotb作为分子载体将破伤风毒素c单位进行融合，这一研究成果为开发新的药物和疫苗提供了新的思路。2007年，学者seok joon kwon成功将β-半乳糖苷酶与芽孢衣壳蛋白cotg融合展示在芽孢表面，可作为全细胞生物催化剂，用于水溶剂双相反应系统中的半乳糖基转移。2014年，韩国学者jae-gu pan等成功在孢子表面展示了羧甲基纤维素酶(cmcase)的天然形式。

3、枯草芽孢杆菌作为一种可食用的益生菌，也是当前口服疫苗载体的研究主流。从2001年报道了意大利学者medaglini利用芽孢cotb蛋白融合破伤风毒素c单位，研制破伤风口服疫苗开始，越来越多的学者也随之对枯草芽孢杆菌口服疫苗展开深入研究。2007年，学者le h duc利用枯草芽孢杆菌孢子，分别在孢子衣壳和萌发期的孢子中表达了炭疽保护性抗原pa，并进行了小鼠免疫保护实验，证实免疫后的小鼠可获得较高水平的保护性免疫。2016年，四川农业大学以枯草芽孢杆菌芽孢蛋白cotb作为孢子锚定蛋白，将pedvs蛋白表达在孢子表面，并验证具有良好的免疫原性。

4、自2016年起，bacillus subtilis中建立了多种基于crispr-cas9的基因编辑系统。由于此类系统需要表达cas9以及靶向特定基因的sgrna，因此可以通过基因组的整合表达、单质粒表达或是双质粒表达来实现。其中基因组的整合表达操作较为繁琐且不利于相关元件的消除与连续操作；而单质粒系统的质粒较大，不利于sgrna和同源片段的连接构建以及转化，因此将cas9以及sgrna分开表达的双质粒系统是目前的最优选择。其中，cas9的表达载体再进行基因编辑是无需做任何修改只要直接转化即可，只需根据需要进行的基因操作对sgrna的表达载体进行修改即可，而且同源模板也可以一同放置于第二个载体上从而显著提高基因编辑的效率。

5、猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,pedv)、猪传染性胃肠炎病毒(transmissible gastroenteritis virus,tgev)和猪德尔塔冠状病毒(porcinedeltacoronavirus,pdcov)是近年来全球猪业最为重要的三种腹泻性病毒之一。这些病毒引起的疾病不仅导致严重的经济损失，还对畜牧业的可持续发展提出了挑战。它们的病毒粒子形状呈球形或不规则形，带有囊膜，大小在80-120nm之间。这些病毒的基因组结构为单股的正向rna，其5’端带有帽子结构，后跟着6-11个开放阅读框。这种病毒基因组的2/3由第一个阅读框编码复制酶，剩下的1/3主要编码结构蛋白，其中包括纤突蛋白(spike，s)、小包膜蛋白(envelope，e)、囊膜蛋白(membrance，m)以及核蛋白(nucleocapsid，n)。e和m蛋白在病毒的装配过程中扮演重要角色，n蛋白将基因组包裹形成核蛋白复合体，而s蛋白则通过与宿主细胞受体结合介导病毒入侵，并决定病毒的组织或宿主嗜性。pedv的主要抗原为s蛋白，在pedv感染的初期，机体产生的抗体以中和s蛋白为主，从而抑制pedv进一步感染。但是，s蛋白的高可变性使得许多免疫原性位点在不断改变，这增加了pedv的恶性程度。tgev抗原亦为s蛋白，它能够诱导机体产生抗体和细胞免疫反应。在tgev感染的初期，机体所产生的抗体主要针对s蛋白，从而抑制tgev的进一步感染。pdcov是一种双股负链rna病毒，其基因组长度为25kb。pdcov具有s、n、m等结构蛋白，其中s蛋白是pdcov最重要的抗原。pdcov是一种新型的冠状病毒，它在2012年首次被发现，之后在全球范围内传播。pdcov对养猪业产生了严重的威胁，特别是在亚洲地区。虽然pdcov已经引起了人们的高度关注，但目前仍缺乏有效的预防和控制手段。

6、猪腹泻病毒作为一种广泛传播的猪病毒疾病，对猪场的健康管理和疾病控制造成严重影响。因此，建立高效的猪腹泻病毒疫苗研究系统具有重要意义。当前市面上流通的猪腹泻病毒疫苗主要有灭活疫苗和活疫苗两种类型，但这两种疫苗均存在一些缺点。首先，灭活疫苗的免疫效果相对较弱，需要大量接种才能产生有效的免疫力。此外，灭活疫苗在保存和运输过程中容易失活，从而影响疫苗的免疫效果。其次，活疫苗虽然能够促进免疫系统产生强效的免疫应答，但同时也存在着一些潜在的风险。活疫苗可能会在接种过程中导致疫苗株与野生病毒株之间的杂交，从而导致疫苗株的变异，甚至改变其病原性。此外，由于猪腹泻病毒存在多个亚型，因此市场上的疫苗也无法保证对所有亚型都有良好的免疫效果，这亦是现有疫苗存在的一个限制，因此寻求新的疫苗预防方法是非常重要的。

7、pedv和tgev的疫苗接种已经成为预防和控制这两种病毒感染的主要手段。目前，市场上已经有多种pedv和tgev的疫苗可供选择，包括灭活疫苗、弱毒活疫苗、基因工程疫苗等。这些疫苗的接种能够有效地提高机体对pedv和tgev的免疫力，从而减轻其感染的程度。然而，由于pedv和tgev的s蛋白存在着较大的变异性，这给疫苗的研发带来了很大的挑战。因此，科学家们正在不断努力研制更加安全、有效的pedv和tgev疫苗，以应对不断变异的病毒株。与pedv和tgev相比，pdcov的疫苗研发相对滞后，目前尚未有可用的pdcov疫苗问世。这主要是因为pdcov的基因组结构与其他冠状病毒不同，导致其抗原表位较为复杂，难以快速准确地鉴定出有效的抗原。

8、pedv、tgev和pdcov是三种对养猪业造成影响的重要肠道病毒，在全球范围内都存在着一定的流行。这些病毒的抗原主要为s蛋白，但由于其高变异性，对于疫苗的研发提出了更高的要求，因此，建立高效的猪腹泻病毒疫苗研究系统具有重要意义，由于猪腹泻病毒存在多个亚型，因此市场上的疫苗也无法保证对所有亚型都有良好的免疫效果，这亦是现有疫苗存在的一个限制，因此寻求新的疫苗预防方法是非常重要的。

技术实现思路

1、发明目的：针对现有技术存在的问题，本发明提供三种孢子蛋白融合稳定展示猪腹泻病毒三种关键抗原重组枯草芽孢杆菌，本发明的重组菌可以将三种猪腹泻病毒展示在三种不同的芽孢杆菌孢子表面，也可以将三种不同猪腹泻病毒抗原展示在同一株枯草芽孢杆菌三种不同的孢子蛋白表面。本发明的猪腹泻病毒重组菌不仅能诱导小鼠机体全身免疫反应，也能在肠道中起到调节肠道菌群，定殖的作用。本发明构建的猪腹泻病毒重组菌具有显著的免疫效力，具有诱导igg抗体、中和抗体、体液免疫和细胞免疫的能力，且以枯草芽孢杆菌作为递送蛋白宿主菌，具有调节小鼠肠道菌群，提高小鼠身体素质的能力，为猪腹泻病毒三联新型口服疫苗的研究奠定基础。

2、本发明还提供所述利用三种孢子蛋白融合稳定展示猪腹泻病毒三种关键抗原重组枯草芽孢杆菌的构建方法和应用。

3、技术方案：为了实现上述目的，本发明所述三种孢子蛋白融合稳定展示猪腹泻病毒三种关键抗原重组枯草芽孢杆菌，所述重组菌以枯草芽孢杆菌为出发菌株，将包含cas9蛋白的表达载体pbe-cas9以及优化的pdcov、tgev和pedv三种猪腹泻病毒的关键抗原部分s1蛋白片段合成基因pdcov-s1、tgev-s1和pedv-s1中的任意一种或者多种转入枯草芽孢杆菌中，所述pdcov-s1、tgev-s1和pedv-s1其序列分别如seq id no.1-3所示。

4、其中，所述重组菌以枯草芽孢杆菌为出发菌株，将包含cas9蛋白的表达载体pbe-cas9以及关键抗原s1的猪腹泻病毒pdcov、tgev和pedv的抗原表达载体ptn-cota-pdcov、ptn-cotb-tgev和ptc-cgea-pedv中的任意一种或者多种转入枯草芽孢杆菌中，所述ptn-cota-pdcov、ptn-cotb-tgev和ptc-cgea-pedv其序列分别为seq id no.4-6所示。

5、其中，所述表达载体pbe-cas9以pbe为基础载体，包含大肠杆菌复制起点(ori)、枯草芽孢杆菌热敏复制起点(rep-ts)、枯草芽孢杆菌p43启动子、cas9蛋白表达框、用于大肠杆菌的筛选标记基因青霉素抗性基因(ampr)和用于芽孢杆菌筛选的红霉素抗性基因ermr。

6、其中，所述抗原表达载体ptn-cota-pdcov以ptn为基础载体，包含用于大肠杆菌的筛选标记基因青霉素抗性基因(ampr)、用于芽孢杆菌筛选的新霉素抗性基因neor、孢子蛋白表达框cota，猪德尔塔冠状病毒pdcov的s1蛋白、大肠杆菌复制起点(ori)、枯草芽孢杆菌热敏复制起点(rep-ts)、枯草芽孢杆菌p43启动子和带有靶标序列的sgrna1。

7、其中，所述抗原表达载体ptn-cotb-tgev以ptn为基础载体，包含用于大肠杆菌的筛选标记基因青霉素抗性基因(ampr)、用于芽孢杆菌筛选的新霉素抗性基因neor、孢子蛋白表达框cotb，猪传染性胃肠炎病毒tgev的s1蛋白、大肠杆菌复制起点(ori)、枯草芽孢杆菌热敏复制起点(rep-ts)、枯草芽孢杆菌p43启动子和带有靶标序列的sgrna2。

8、其中，所述抗原表达载体ptc-cgea-pedv以ptc为基础载体，包含用于大肠杆菌的筛选标记基因青霉素抗性基因(ampr)、用于芽孢杆菌筛选的氯霉素抗性基因clr、孢子蛋白表达框cgea，猪流行性腹泻病毒pedv的s1蛋白、大肠杆菌复制起点(ori)、枯草芽孢杆菌热敏复制起点(rep-ts)、枯草芽孢杆菌p43启动子和带有靶标序列的sgrna3。

9、其中，分别选用pdcov、tgev和pedv三种猪腹泻病毒的关键抗原部分s1蛋白片段合成基因进行优化合成pdcov-s1、tgev-s1和pedv-s1，同时替换荧光蛋白表达载体ptn-cota-rfp、ptn-cotb-yfp和ptc-cgea-gfp中的荧光蛋白基因，构建猪腹泻病毒表达载体ptn-cota-pdcov、ptn-cotb-tgev和ptc-cgea-pedv。所述荧光蛋白表达载体ptn-cota-rfp、ptn-cotb-yfp和ptc-cgea-gfp已在在先专利“一种野生型枯草芽孢杆菌jcl16多质粒基因编辑系统及其构建与应用中构建成功，中国申请号2022117265678.7。

10、其中，所述枯草芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌jcl16。

11、本发明所述的三种孢子蛋白融合稳定展示猪腹泻病毒三种关键抗原重组枯草芽孢杆菌的构建方法，包括如下步骤：

12、(1)将构建好的pbe-cas9质粒和含有猪腹泻病毒关键抗原s1蛋白的表达质粒ptn-cota-pdcov、ptn-cotb-tgev和ptc-cgea-pedv质粒分别转入大肠杆菌感受态细胞dh5a，大批量扩增提取质粒；

13、(2)将提取的pbe-cas9质粒分别与ptn-cota-pdcov、ptn-cotb-tgev和ptc-cgea-pedv质粒任意一种或者多种转入枯草芽孢杆菌感受态，进行培养，得到重组菌。

14、进一步地，提取转化重组菌的基因组，进行基因组pcr验证重组菌是否转化成功；提取重组菌芽孢蛋白液，进行western-blot和ifa验证三种猪腹泻病毒关键抗原蛋白是否成功表达。

15、本发明所述的利用三种孢子蛋白融合稳定展示猪腹泻病毒三种关键抗原重组枯草芽孢杆菌在制备猪腹泻病毒疫苗中的应用。

16、其中，所述利用三种孢子蛋白融合稳定展示猪腹泻病毒三种关键抗原重组枯草芽孢杆菌在制备猪腹泻病毒口服疫苗中的应用。

17、进一步地，本发明所述三种孢子蛋白融合稳定展示猪腹泻病毒三种关键抗原重组枯草芽孢杆菌在制备诱导产生猪腹泻病毒关键抗原的特异性抗体的疫苗中的应用。

18、更进一步地，所述抗原为pdcov、tgev和pedv三种猪腹泻病毒的关键抗原。本发明首先构建包含cas9蛋白的表达载体pbe-cas9(中国专利申请号2022117265678.7)；然后构建包含p43强启动子、sgrna、孢子蛋白cotr、及关键抗原s1的猪腹泻病毒(pdcov、tgev和pedv)抗原表达载体ptn-cota-pdcov、ptn-cotb-tgev和ptc-cgea-pedv；再将上述任意一种抗原表达载体与表达载体pbe-cas9一起转入枯草芽孢杆菌中，构建表达猪腹泻病毒抗原的重组枯草芽孢杆菌；进一步制备小鼠免疫重组菌，进行重组菌免疫原性初评价。

19、进一步地，制备小鼠免疫重组菌，进行重组菌免疫原性初评价，所述免疫原性评价包括以下步骤：

20、(1)制备免疫重组菌，将验证表达的重组菌用芽孢培养基进行芽孢化培养，调整菌体浓度至终浓度7×1010cfu，离心收集菌体，并混以10％的脱脂奶粉进行混悬；

21、(2)将重悬的重组菌对balb/c小鼠进行灌胃免疫，同时设置pbs对照组，免疫周期分三次，每次连续免疫三天，分别在小鼠免疫14、28、42天后采集粪便及血清，并在三免后14天处死小鼠采集脾脏淋巴细胞及小肠内容物；

22、(3)对步骤(2)中采集的血液及脾淋巴细胞进行elisa、中和抗体检测及细胞因子检测，对检测数据进行分析，评价重组菌免疫原性。

23、本发明利用基因编辑技术提高了双质粒的构建效率和疫苗的抗原表达率，通过构建双质粒基因编辑系统，利用crispr-cas9技术在枯草芽孢杆菌不同的孢子表面分别展示三种猪腹泻病毒(pedv、pdcov和tgev)的关键抗原s1基因片段(seq id no.1-3所示)。本构建发明的重组菌对小鼠的免疫原性评价，检测小鼠血清igg，中和抗体，淋巴细胞因子等免疫指标，表明枯草芽孢杆菌灌胃免疫可以诱导小鼠产生特异性免疫反应，使小鼠体内产生抵御猪腹泻病毒的抗体，为三联口服疫苗的研制提供了新思路和新方法，有助于开发新的预防控制策略，提高疾病的防治能力。为下面猪病毒性腹泻口服疫苗的研究奠定基础。

24、本发明选用枯草芽孢杆菌芽孢衣壳蛋白cgea、cota和cotb分别展示猪腹泻病毒pedv、pdcov和tgev的s1片段，本发明利用crispr-cas9成功构建了枯草芽孢杆菌双质粒基因编辑系统，并在不同的芽孢衣壳蛋白上成功表达荧光蛋白，并进一步构建了pedv、pdcov和tgev三种猪腹泻病毒重组菌，并且本发明的重组菌可以将三种猪腹泻病毒展示在三种不同的芽孢杆菌孢子表面，也可以将三种不同猪腹泻病毒抗原展示在同一株枯草芽孢杆菌三种不同的孢子蛋白表面。

25、本发明中利用构建的大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭质粒载体pbe、ptn、ptc，为双质粒基因编辑系统的建立提供基础骨架。通过crispr-cas9基因编辑系统，成功构建枯草芽孢杆菌芽孢衣壳蛋白表面展示荧光蛋白表达载体ptn-cota-rfp、ptc-cgea-gfp、ptn-cotb-yfp，并筛选到正确表面表达荧光蛋白的重组菌，为双质粒基因编辑系统工作的检测提供有力依据，进而成功构建枯草芽孢杆菌表面展示猪腹泻病毒关键抗原表达载体ptn-cota-pdcov、ptc-cgea-pedv、ptn-cotb-tgev，并成功筛选到芽孢表面展示猪腹泻病毒抗原的重组菌，并通过小鼠免疫三种重组猪腹泻病毒枯草芽孢杆菌，检测小鼠血清igg，中和抗体，淋巴细胞因子等免疫指标，本发明的重组菌对于动物免疫实验验证其具有良好的免疫效果，为猪腹泻病毒相关新型三联口服疫苗的研究提供研究基础。相比于传统的猪腹泻疫苗，本发明中枯草芽孢杆菌表面展示猪腹泻病毒的方法热稳定好，芽孢能在常温下长期存储，不需要冷链存储和运输；免注射，可以通过口服给药来免疫；相比传统的疫苗，芽孢展示技术的生产成本更低且芽孢的保质期长，便于储存；枯草芽孢杆菌表面可以展示不同病原体的抗原，适用于不同病原体的疫苗研究。本发明的猪腹泻病毒重组菌不仅能诱导小鼠机体全身免疫反应，也能在肠道中起到调节肠道菌群，定殖的作用。并且本发明的重组菌可以将三种猪腹泻病毒展示在三种不同的芽孢杆菌孢子表面，也可以将三种不同猪腹泻病毒抗原展示在同一株枯草芽孢杆菌三种不同的孢子蛋白表面。

26、本发明的猪腹泻病毒重组菌不仅能诱导小鼠机体全身免疫反应，也能在肠道中起到调节肠道菌群，定殖的作用；并且本发明的重组菌可以将三种猪腹泻病毒展示在三种不同的芽孢杆菌孢子表面，也可以将三种不同猪腹泻病毒抗原展示在同一株枯草芽孢杆菌三种不同的孢子蛋白表面，并且有良好的免疫力。本发明通过crispr-cas9基因编辑系统成功将外源蛋白展示在枯草芽孢杆菌表面，证实了双质粒基因编辑系统的成功建立，除了本发明中的蛋白，后续还可以进行其他枯草芽孢杆菌基因编辑技术的研究。

27、本发明通过构建双质粒基因编辑系统，利用crispr-cas9技术在枯草芽孢杆菌不同的孢子表面首次分别展示三种猪腹泻病毒(pedv、pdcov和tgev)的关键抗原s1基因片段。本发明利用枯草芽孢杆菌芽孢作为猪腹泻病毒s1抗原呈载体灌胃小鼠，通过间接elisa检测方法和间接免疫荧光ifa可检测到猪腹泻病毒特异性igg抗体，并通过中和抗体检测免疫小鼠血清中和效价最高可达到1：64；通过对免疫小鼠脾淋巴细胞检测，重组菌可诱导淋巴细胞增殖并上调细胞因子il-4和ifn-γ的分泌水平，同时还可以提高t、b淋巴细胞数量比例；通过对免疫小鼠体重等一般身体状况的监测发现枯草芽孢杆菌可提高机体对营养成分的摄入，增长体重，并从小鼠粪便及肠道中检测到免疫菌株的停留。综上所述，猪腹泻病毒重组菌不仅能诱导小鼠机体全身免疫反应，也能在肠道中起到调节肠道菌群，定殖的作用。

28、本发明采用特定的枯草芽孢杆菌作为新型的纳米材料，具有耐高温、耐酸碱等其它极端环境。采用孢子的表面蛋白来表达抗原具有抵抗动物胃肠道酸和蛋白酶的降解。相对于孢内和孢外抗原表达，孢子表面具有表达稳定性好、表达活性和安全性较高以及可以展示多种生物分子的能力等优点。

29、有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下优点：

30、本发明利用基因编辑技术提高了双质粒或者多质粒的构建效率和疫苗的抗原表达率，本发明通过构建双质粒或者多质粒基因编辑系统，利用crispr-cas9技术在枯草芽孢杆菌不同的孢子表面分别展示三种猪腹泻病毒(pedv、pdcov和tgev)的关键抗原s1基因片段，为三联口服疫苗的研制提供了新思路和新方法，也将有助于开发新的预防控制策略，提高疾病的防治能力。

31、本发明成功构建大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭质粒载体pbe、ptn、ptc，为双质粒基因编辑系统的建立提供基础骨架。通过crispr-cas9基因编辑系统，成功构建枯草芽孢杆菌表面展示猪腹泻病毒关键抗原表达载体ptn-cota-pdcov、ptc-cgea-pedv、ptn-cotb-tgev，并成功筛选到芽孢表面展示猪腹泻病毒抗原的重组菌，利用枯草芽孢杆菌芽孢作为猪腹泻病毒s1抗原呈载体灌胃小鼠，通过间接elisa检测方法和间接免疫荧光ifa可检测到猪腹泻病毒特异性igg抗体，并通过中和抗体检测免疫小鼠血清中和效价最高可达到1：64；通过对免疫小鼠脾淋巴细胞检测，重组菌可诱导淋巴细胞增殖并上调细胞因子il-4和ifn-γ的分泌水平，同时还可以提高t、b淋巴细胞数量比例；通过对免疫小鼠体重等一般身体状况的监测发现枯草芽孢杆菌可提高机体对营养成分的摄入，增长体重，并从小鼠粪便及肠道中检测到免疫菌株的停留。

32、综上所述，本发明的重组菌不仅能诱导小鼠机体全身免疫反应，也能在肠道中起到调节肠道菌群，定殖的作用，这一研究结果为猪腹泻病毒新型口服疫苗的探索奠定了研究基础。