核酸脂质纳米颗粒复合物中核酸的定量检测方法与流程

本技术涉及核酸检测，具体涉及一种核酸脂质纳米颗粒复合物中核酸的定量检测方法。

背景技术：

1、包载核酸的lnp制剂在使用过程中需要确认药物有效包载浓度。因此准确地测定lnp制剂实际包载药物浓度与包封率较为重要。

2、通常，包载核酸的lnp制剂中核酸含量的测定方法：先检测未破乳前溶液中游离的核酸浓度clnp中游离的核酸，再通过加入一定浓度的triton-100进行破乳，使lnp制剂内部的核酸全部释放，并对溶液中的核酸总量进行测定得到clnp-rna全部核酸，最后通过公式计算包封率(如公式1所示)从而准确地测定了lnp制剂内部包载的核酸浓度及其包封率。例如，使用ribogreen测定mrna-lnp的包封率和其mrna浓度。

3、

4、随着永久性阳离子脂质或化合物在lnp核酸制剂中的广泛应用，发明人在使用triton-100破乳检测其全部核酸浓度时，出现破乳不充分进而导致检测浓度与理论值相差较大的问题。

5、因此，期望提供一种可充分裂解含永久性阳离子脂质的lnp核酸制剂，用以准确地定量测定其有效核酸浓度及包封率。

6、现有技术文献

7、非专利文献1pharmaceutics 2022,14,2086

8、专利文献2wo 2022/204286 al

技术实现思路

1、非专利文献1公开使用1％(v/v)triton-100裂解含有dotap包载sirna的lnp，同时使用ribogreen试剂盒检测其包封率，但未说明是否可以使用该方法准确检测sirna的含量，此外该文中通过使用琼脂糖凝胶电泳对lnp-sirna仅进行了定性分析。

2、专利文献2中公开使用triton-100并使用ribogreen试剂盒检测含有阳离子脂质(sort lipid)包载核酸的lnp的包封率，其中核酸包括mrna、sgrna、cas9 mrna。对于sirna的包载率检测以及定量检测，专利文献1中未见公开或详细的描述。

3、现有研究中对于含有阳离子脂质包载sirna的lnp的包封率通常使用triton-100进行破乳，并使用ribogreen试剂盒进行包封率的检测，而在该方法下，对于lnp包载的sirna定量检测未有公开明确的说明。

4、本发明通过使用十二烷基硫酸钠(以下，有时称为“sds”)对包载有核酸的lnp进行破乳，并用本领域用于核酸含量检测的方法、试剂盒等进行核酸含量的定量检测以及包封率检测，例如microrna试剂盒。

5、本技术的第一方面提供一种核酸脂质纳米颗粒复合物中核酸的定量检测方法，使用十二烷基硫酸钠作为破乳剂。

6、在一个优选的实施方式中，所述核酸脂质纳米颗粒复合物包含永久性阳离子脂质，所述永久性阳离子脂质的pka为9以上，优选地，所述永久性阳离子脂质的pka为14以上。

7、所述永久性阳离子脂质包含选自磷脂、糖类、蛋白、氨基酸、维生素和sort脂质中的一种以上。

8、在一个优选的实施方式中，所述永久性阳离子脂质为选自n，n-二羟乙基甲基-n-2-(胆固醇氧羰基氨基)乙基溴化铵(bhem-chol)、(2,3-二油氧基丙基)三甲基氯化铵(dotap)、n-(l-(2，3-二油酰氧基)丙基)-n，n，n-三甲基氯化铵(dotma)中的一种以上。

9、在一个优选的实施方式中，所述核酸碱基对数量为1000以下，优选地，所述核酸碱基对数量为500以下。

10、优选地，所述核酸选自sirna、mrna、trna、rrna、cdna、mirna、核酶、反义寡核苷酸、质粒dna、肽核酸、三链形成型寡核苷酸(triplex forming oligonucleotide,tfo)、基因中的一种以上，更优选地，所述的核酸为sirna。

11、在一个优选的实施方式中，所述十二烷基硫酸钠的破乳浓度为0.20wt％-3wt％，优选为0.25wt％-2.5wt％，更优选0.25％-1wt％。

12、在一个优选的实施方式中，所述十二烷基硫酸钠的破乳浓度为0.25wt％、0.3wt％、0.35wt％、0.4wt％、0.45wt％、0.5wt％、0.6wt％、0.7wt％、0.8wt％、0.9wt％、1wt％、1.5wt％、2wt％或2.5wt％。在一个优选的实施方式中，利用十二烷基硫酸钠进行破乳的时间范围是10分钟至12小时，进一步可以为15分钟至12小时。

13、优选地，所述破乳的时间是10分钟、15分钟、30分钟、1小时、3小时、6小时或12小时。

14、在一个优选的实施方式中，利用十二烷基硫酸钠进行破乳的温度是25±2℃至37±2℃，优选地，所述破乳的温度是30±2℃至37±2℃，优选地，所述破乳的温度是25±2℃、26±2℃、27±2℃、28±2℃、29±2℃、30±2℃、31±2℃、32±2℃、33±2℃、34±2℃、35±2℃、36±2℃、37±2℃。

15、在一个优选的实施方式中，核酸脂质纳米颗粒复合物中核酸的定量检测方法包括以下步骤：

16、s1：检测核酸脂质纳米颗粒复合物中游离核酸浓度；

17、s2：使用十二烷基硫酸钠作为破乳剂，对核酸脂质纳米颗粒复合物进行破乳；

18、s3：检测总核酸浓度。

19、进一步地，所述方法还包括：

20、s4：根据游离核酸浓度和总核酸浓度，计算包封率。

21、在一个实施方式中，所述核酸脂质纳米颗粒复合物是通过以下方法制备得到的：按配方量混合脂质，再与荷载混合，即得。

22、在一个优选的实施方式中，所述核酸脂质纳米颗粒复合物是通过以下方法制备得到的，所述方法包括以下步骤：

23、s1：将可电离阳离子脂质、永久性阳离子脂质、结构脂质、聚合物共轭脂质溶于有机溶剂中，制得到脂质溶液，任选地，此步骤中还包括将辅助脂质溶于有机溶剂中；

24、s2：将核酸溶于缓冲液中，制得核酸原液；

25、s3：将脂质溶液和核酸原液充分混匀后得到混合液，替换混合液中的有机溶剂为溶媒缓冲液后制得核酸脂质纳米颗粒复合物。

26、在一个实施方式中，所述溶媒缓冲溶液为磷酸盐缓冲液，进一步可以为杜氏磷酸盐缓冲液(dpbs)。

27、在一个优选的实施方式中，使用microrna检测试剂盒对核酸脂质纳米颗粒复合物中的核酸进行定量检测。

28、在一个优选的实施方式中，所述核酸脂质纳米颗粒复合物包括但不限于核酸、可电离阳离子脂质、结构脂质、辅助脂质、永久性阳离子脂质和聚合物共轭脂质；其配方和制备方法本领域技术人员可根据现有技术获得。

29、为了更清晰的描述本技术的技术方案，我们提供一种核酸脂质纳米颗粒复合物，其包含：

30、(a)核酸；

31、(b)可电离阳离子脂质，其占所述颗粒中存在的总脂质的10mol％-80mol％；

32、(c)结构脂质，其占所述颗粒中存在的总脂质的3mol％-80mol％；

33、(d)辅助脂质，其占所述颗粒中存在的总脂质的0mol％-20mol％；

34、(e)永久性阳离子脂质，其占所述颗粒中存在的总脂质的15mol％-80mol％；

35、(f)聚合物共轭脂质,其占所述颗粒中存在的总脂质的0.1mol％-7.5mol％。

36、在一个实施方式中，所述可电离阳离子脂质占所述颗粒中存在的总脂质的20mol％-55mol％，例如可以为23.8mol％或24mol％。

37、在一个实施方式中，所述结构脂质占所述颗粒中存在的总脂质的10mol％-60mol％，例如可以为17.8mol％、25mol％或38.5mol％。

38、在一个实施方式中，所述辅助脂质占所述颗粒中存在的总脂质的0mol％-10mol％，例如可以为0mol％或7.5mol％。

39、在一个实施方式中，所述永久性阳离子脂质占所述颗粒中存在的总脂质的20mol％-50mol％，例如可以为50mol％。

40、在一个实施方式中，所述聚合物共轭脂质占所述颗粒中存在的总脂质的0.25mol％-2mol％，进一步可以为0.9mol％、1mol％或1.5mol％。

41、在一实施方式中，所述核酸脂质纳米颗粒复合物n/p为1-20，优选2-10，更优选3、4、5、6、7或8。

42、在一个实施方式中，所述可电离阳离子脂质(有的文献中也称为阳离子脂质)可选自本领域现有技术中公开的分子，如wo2013086354、wo2011153493、cn115850104a中公开、或中国申请cn202310744585.7、cn2023107445013.0、cn202311255442.6中公开的可电离阳离子脂质中的任一种以上。

43、在一个优选的实施方式中，所述可电离阳离子脂质包括选自1,2-二油酰基氧基-3-二甲基氨基丙烷(dodap)、1,2-二油基氧基-3-二甲基氨基丙烷(dodma)、1,2-二亚油基氧基-3-二甲基氨基丙烷(dlindma)、2,2-二亚油酰基-4-(2-二甲基氨基乙基)-[1,3]-二氧杂环戊烷(dlin-kc2-dma)、4-(n,n-二甲基氨基)丁酸(二亚油基)甲酯(dlin-mc3-dma)、8-[(2-羟乙基)(6-氧代-6-癸氧基己基)氨基]辛酸(十七烷-9-基)酯(sm-102)和[(4-羟基丁基)氮杂二基]双(己烷-6,1-二基)双(2-己基癸酸酯)(alc-0315)；优选自4-(n,n-二甲基氨基)丁酸(二亚油基)甲酯(dlin-mc3-dma)和/或[(4-羟基丁基)氮杂二基]双(己烷-6,1-二基)双(2-己基癸酸酯)(alc-0315)、8-[(2-羟乙基)[6-氧代-6-(十一烷基氧基)己基]氨基]辛酸1-辛基壬基酯(sm-102)、辛酸七烷-9-基8-(2-羟乙基)(8-壬氧基)-8-氧辛基)氨基酯(lipid5)、4-(n,n-二甲基氨基)丁酸(二亚油基)甲酯(mc3)中的一种以上。在一个优选的实施方式中，所述结构脂质包括胆固醇及其衍生物中的一种或者多种，优选为胆固醇、谷甾醇、粪甾醇、岩皂甾醇、菜籽甾醇、麦角固醇、番茄碱、熊果酸、α-生育酚、豆甾醇、燕麦甾醇、麦角骨化醇和菜油甾醇中的一种或多种，更优选为胆固醇和/或β-谷甾醇。

44、在一个优选的实施方式中，所述辅助脂质选自不同结构类型的磷脂，代表性的辅助脂质包括二酰基磷脂酰胆碱、二酰基磷脂酰乙醇胺、神经酰胺、鞘磷脂、二氢鞘磷脂、脑磷脂和脑苷脂。

45、优选地，所述辅助脂质包括选自氢化大豆磷脂酰胆碱(hspc)；1,2-二癸酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(ddpc)；1,2-二瓢儿菜基-sn-甘油基-3-磷酸酯(depa)；1,2-二反油酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(depc)；1,2-二瓢儿菜基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(depe)；1,2-二反油酰基-磷脂酰甘油(depg)；1,2-二亚油酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(dlopc)；1,2-二月桂酰基-sn-甘油基-3-磷酸酯(dlpa)；1,2-二月桂酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(dlpc)；1,2-二月桂酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(dlpe)；1,2-二月桂酰基-sn-甘油基-3-磷脂酰甘油(dlpg)；1,2-二月桂酰基-sn-甘油基-3-磷酸丝氨酸(dlps)；1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油基-3-磷酸酯(dmpa)；1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(dmpc)；1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(dmpe)；1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油基-3-磷脂酰甘油(dmpg)；1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油基-3-磷酸丝氨酸(dmps)；1,2-二油酰基-sn-甘油基-3-磷酸酯(dopa)；1,2-二油酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(dopc)；1,2-二油酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(dope)；1,2-二油酰基-sn-甘油基-3-磷脂酰甘油(dopg)；1,2-二油酰基-sn-甘油基-3-磷酸丝氨酸(dops)；1,2-二棕榈酰基-sn-甘油基-3-磷酸酯(dppa)；1,2-二棕榈酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(dppc)；1,2-二棕榈酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(dppe)；1,2-二棕榈酰基-sn-甘油基-3-磷脂酰甘油(dppg)；1,2-二棕榈酰基-sn-甘油基-3-磷酸丝氨酸(dpps)；1,2-二硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷酸酯(dspa)；1,2-二硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(dspc)；1,2-二硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(dspe)；1,2-二硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷脂酰甘油(dspg)；1,2-二硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷酸丝氨酸(dsps)；1-肉豆蔻酰基-2-棕榈酰基-sn-甘油基3-磷酸胆碱(mppc)；1-肉豆蔻酰基-2-硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(mspc)；1-棕榈酰基-2-肉豆蔻酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(pmpc)；1-棕榈酰基-2-油酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(popc)；1-棕榈酰基-2-油酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(pope)；1-棕榈酰基-2-油酰基-sn-甘油基-3-磷脂酰甘油(popg)；1-棕榈酰基-2-硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(pspc)；1-硬脂酰基-2-肉豆蔻酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(smpc)；和1-硬脂酰基-2-油酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(sopc)；1-硬脂酰基-2-棕榈酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(sppc)中的一种以上。

46、在本说明书中，永久性阳离子脂质是指本身具有正电荷的脂质分子，其不会随溶液ph的变化而改变电性。

47、在一个优选的实施方式中，所述永久性阳离子脂质包含选自磷脂、糖类、蛋白、氨基酸、维生素和sort脂质中的一种以上。

48、所述永久性阳离子脂质选自二甲基二(十八烷基)溴化铵盐(ddab)、1，2-二肉豆蔻酰基-3-三甲基铵丙烷、1，2-二油酰基-3-三甲基铵丙烷(dotap)、1，2-二油酰基-3-三甲基铵丙烷甲基硫酸盐、1，2-二棕榈酰基-3-三甲基铵丙烷、1，2-二硬脂酰基-3-三甲基铵丙烷、n-(l-(2，3-二油酰氧基)丙基)-n，n，n-三甲基氯化铵(dotma)、二肉豆蔻酰基氧基丙基二甲基羟基乙基溴化铵盐(dmrie)、二油酰氧基丙基二甲基羟基乙基溴化铵(dorie)、二甲基二(十二烷基)溴化铵、n-(a-三甲基铵基乙酰基)-二(十二烷基)-d-谷氨酰胺盐酸盐、n-(a-三甲基铵基乙酰基)-o，o'-双-(1h，1h，2h，2h-全氟癸烷基)-l-谷氨酰胺盐酸盐、o，o'-二(十二烷酰基)-n-(a-三甲基铵基乙酰基)二乙醇胺盐酸盐、甲基烯丙基二(十二烷基)溴化铵、n-{p-(w-三甲基铵基丁基氧基)-苯甲酰基}-二(十二烷基)-l-谷氨酰胺盐酸盐、9-(w-三甲基铵基丁基)-3,6-双(十二烷酰基)咔唑溴化物、二甲基二(十八烷基)铵盐酸盐、n-w-三甲基铵基癸酰基-二(十六烷基)-d-谷氨酰胺溴化物、n-{p-(w-三甲基铵基己基氧基)-苯甲酰基}-二(十四烷基)-l-谷氨酰胺溴化物、p-(w-三甲基铵基癸基氧基)-ρ'-辛氧基偶氮苯溴化物盐(mc-1-0810)、p-{w-(b-羟基乙基)二甲基-铵基-癸基氧基}-ρ'-辛氧基偶氮苯溴化物盐(mc-3-0810)、o,o',o"-三(十二烷酰基)-n-(w-三甲基-铵基癸酰基)-三(羟基甲基)氨基甲烷澳化物盐(tc-1-12)、1，2-二月桂基-甘油-3-乙基磷酸胆碱、1，2-二肉豆蔻酰基-甘油-3-乙基磷酸胆碱、1，2-二棕榈酰基-甘油-3-乙基磷酸胆碱、1，2-二硬脂酰基-甘油-3-乙基磷酸胆碱、1，2-二油酰基-甘油-3-乙基磷酸胆碱、1-棕榈酰基-2-油酰基-甘油-3-乙基磷酸胆碱、n，n-二羟乙基甲基-n-2-(胆固醇氧羰基氨基)乙基溴化铵(bhem-chol)、(2,3-二油氧基丙基)三甲基氯化铵(dotap)和n-(l-(2，3-二油酰氧基)丙基)-n，n，n-三甲基氯化铵中的一种以上。

49、优选地，所述永久性阳离子脂质为选自n，n-二羟乙基甲基-n-2-(胆固醇氧羰基氨基)乙基溴化铵(bhem-chol)、(2,3-二油氧基丙基)三甲基氯化铵(dotap)、n-(l-(2，3-二油酰氧基)丙基)-n，n，n-三甲基氯化铵(dotma)中的一种以上。

50、所述糖类是阳离子糖类聚合物和共聚物。适用于本技术中的阳离子多糖类包括基于5或6个碳的糖的那些聚合物以及如用环氧乙烷对其进行衍生而制成水溶性的衍生物。这些聚合物可以通过几种排列的任一种如1，4-α、1，4-β、1，3-α、1，3-β和1，6键连接在一起。单体可以呈直链或支链几何排列。

51、所述阳离子多糖类的合适的非限制的实例包括基于下列物质的那些：纤维素和羟烷基纤维素；淀粉和羟烷基淀粉；基于阿拉伯糖单体的聚合物；由木糖单体衍生的聚合物；由岩藻糖衍生的聚合物；由果糖单体衍生的聚合物；基于含酸的糖单体如半乳糖醛酸和葡萄糖醛酸的聚合物；基于胺糖单体如半乳糖胺和葡糖胺特别是乙酰葡糖胺的聚合物；基于5或6员环的多元醇单体的聚合物；基于半乳糖单体的聚合物；基于甘露糖单体的聚合物和基于半乳甘露聚糖单体的聚合物。

52、所述蛋白是以偶联剂将乙二胺与蛋白质进行偶联而成。优选地，所述偶联剂为n,n'-羰基二咪唑、4-(n-马来酰亚胺甲基)环己烷羧酸-n-琥珀酰亚胺酯或者其混合物。优选地，所述偶联剂为n,n'-羰基二咪唑。优选地，所述蛋白质为蚕丝蛋白。

53、所述氨基酸包括选自精氨酸、赖氨酸或鸟氨酸中的一种以上。

54、所述维生素包括选自维生素a、维生素b1、维生素b2、维生素b6、维生素e、烟酸、肌醇中的一种以上。

55、所述sort脂质可以是cn112996519a、us11229609b中公开的任一种，其结构可以如以下式(i)所示。

56、

57、其中r1和r2各自独立地是烷基(c8-c24)、烯基(c8-c24)或任一个基团的被取代形式；r3、r3'和r3"各自独立地是烷基c≤6)或被取代的烷基(c≤6)；x是单价阴离子。也可以是本领域中其他具有永久正电基团的脂质分子。

58、在一个优选的实施方式中，聚合物共轭脂质为peg化脂质。

59、在一个优选的实施方式中，所述peg化脂质选自以下一种或多种：peg改性的磷脂酰乙醇胺、peg改性的磷脂酸、peg改性的神经酰胺、peg改性的二烷基胺、peg改性的二酰基甘油和peg改性的二烷基甘油；

60、优选地，所述peg化脂质中包含分子量1000da至20kda的peg部分，优选包含约1000da至约5000da的peg部分；

61、优选地，所述peg化脂质选自dmpe-peg1000、dppe-peg1000、dspe-peg1000、dope-peg1000、ceramide-peg2000、dppe-peg2000、azido-peg2000、dspe-peg2000-mannose、ceramide-peg5000、dspe-peg5000、dspe-peg2000 amine、alc-0159、二肉豆蔻酰甘油-聚乙二醇2000(dmg-peg2000)、二肉豆蔻酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000(dmpe-peg2000))、2-二硬脂酰基-rac-甘油-3-甲氧基聚乙二醇-2000(dsg-peg2000)、1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-n-甲氧基聚乙二醇2000(dspe-peg2000)、1,2-二油酰基-rac-甘油(dog-peg2000)、1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-n-氨基聚乙二醇2000(dope-peg2000)中的一种以上。

62、在一实施方式中，所述复合物包括：核酸、4-(n,n-二甲基氨基)丁酸(二亚油基)甲酯(mc3)、n，n-二羟乙基甲基-n-2-(胆固醇氧羰基氨基)乙基溴化铵(bhem-chol)、胆固醇(cho)、1,2-二油酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(dope)、二肉豆蔻酰甘油-聚乙二醇(dmg-peg)；

63、或，辛酸七烷-9-基8-(2-羟乙基)(8-壬氧基)-8-氧辛基)氨基酯(lipid5)、(2,3-二油氧基丙基)三甲基氯化铵(dotap)、胆固醇(cho)、二肉豆蔻酰甘油-聚乙二醇(dmg-peg)；

64、或，4-(n,n-二甲基氨基)丁酸(二亚油基)甲酯(mc3)、n，n-二羟乙基甲基-n-2-(胆固醇氧羰基氨基)乙基溴化铵(bhem-chol)、胆固醇(cho)、1,2-二油酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(dope)、二肉豆蔻酰甘油-聚乙二醇(dmg-peg)；

65、或，4-(n,n-二甲基氨基)丁酸(二亚油基)甲酯(mc3)、(2,3-二油氧基丙基)三甲基氯化铵(dotap)、胆固醇(cho)、二肉豆蔻酰甘油-聚乙二醇(dmg-peg)。

66、在一实施方式中，所述二肉豆蔻酰甘油-聚乙二醇为二肉豆蔻酰甘油-聚乙二醇2000(dmg-peg2000或dmg-peg2k)。

67、本技术能够取得以下优异的技术效果：sds的破乳效果显著优于triton-100以及其他本领域常用破乳剂，sds能够使核酸脂质纳米颗粒复合物完全破乳，对含有永久阳性离子脂质的核酸脂质纳米颗粒复合物破乳效果更佳。