一种淀粉分支酶干粉制剂的制备方法

本发明属于酶制剂，具体涉及一种淀粉分支酶干粉制剂的制备方法。

背景技术：

1、淀粉分支酶(全称1,4-α-glucan branching enzyme；简称gbe；ec 2.4.1.18)是一种直接参与淀粉生物合成的葡萄糖基转移酶，能够催化断裂α-1,4-糖苷键，裂解产生含有非还原糖末端的短链，通过转糖苷作用催化支链或糖原中分支点的形成，进而形成新的α-1,6-糖苷键。gbe能够催化淀粉等α-葡聚糖分子发生链间糖基转移、链内糖基转移及链内环化三种糖苷键重构反应，通过转糖基反应延缓淀粉粉回生过程，增强淀粉的稳定性并改善淀粉的使用性能，是生物酶法改性淀粉领域的重要酶类之一，具有工艺简单、副产物少、产物得率高的优势，在食品、医药和化工等领域具有非常广阔的应用前景，如淀粉分支酶的高支化特性可以减缓淀粉的消化，避免餐后血糖急剧上升的特性，有益于对糖尿病、肥胖等疾病的调控。

2、目前报道生产的淀粉分支酶主要来源于微生物，通过基因工程技术获得淀粉分支酶高效表达载体，最后经过发酵生产得到液体淀粉分支酶。但大多数淀粉分支酶产量和酶活较低，同时，由于酶属于生物制品，其活性易受到温度、ph、存储条件等环境因素的影响，所以对于液体酶制剂存储条件较为苛刻，其存在占地面积广、长时间存储易产生沉淀和酶易失活染菌等问题，这些问题极大地限制了淀粉分支酶的工业应用。

3、淀粉分支酶在前人的不断研究中已经可以在胞外大量表达，这有利于通过离心、过滤、超滤等手段将其分离出来。而从发酵液中制备固体酶制剂主要包括提取和干燥两个步骤。提取方式主要包括硫酸铵盐或有机溶剂沉淀、脱盐和柱层析纯化步骤，硫酸铵盐沉淀的效率较高，但其后期的除盐工艺较繁琐，铵盐的存在会影响酶的使用场景，同样的，使用有机溶剂沉淀的酶制剂也存在有机溶剂能否全部去除的问题，两者都存在安全问题；柱层析纯化得到的酶蛋白纯度较高，同时除去发酵液的色素，但前期操作较为复杂，洗脱过程繁琐，需要调节到一定的ph，对酶的稳定性要求较高，只适合少量干粉酶制剂的生产，无法满足大规模生产的需要。在干燥方面，目前最常用的制备固体酶制剂的方法有冷冻干燥、真空干燥和喷雾干燥，冷冻干燥技术对酶活性友好，但后期需要粉碎过筛，在生产时存在周期长、能耗高、单次处理量有限以及生产成本高等缺点，真空干燥效率低，不能满足工业的生产需求。相对而言，喷雾干燥技术处理可以较高效地将液体喷雾干燥为固体粉末颗粒，生产效率高，成本低，耗能小，适合大规模生产应用。由于淀粉分支酶属于生物制品，且通过发酵制备的酶液固形物含量低，喷雾干燥需要的干燥温度会较高，高温过程易影响酶蛋白活性，导致酶活力降低，且酶液本身所含的营养物质粘性较高，容易造成喷雾干燥样品量回收率低，产品异味重且吸湿性高。因此，现有酶制剂制备过程中，在提取和干燥工艺中，对于浊度较高的酶液进行除杂、脱色和喷雾干燥存在工艺繁琐、安全性低、酶活回收率低、产品异味重且吸湿性高、不利于储存等技术缺陷。所以，开发一种高效去除发酵液中的杂质，同时有效降低酶液在干燥过程中的酶活损失的方法，对制备固体酶制剂的研究具有重要意义。

技术实现思路

1、为了解决现有技术酶制剂制备过程中除杂脱色工艺的复杂性以及喷雾干燥对淀粉分支酶的酶活影响，本发明的目的是提供一种利用淀粉分支酶发酵液高效制备杂质少、色相好和高酶活回收率的干粉酶制剂的方法。从发酵液中制备固体酶制剂，主要工艺是发酵液先通过离心除菌，后经过氯化钙和活性炭除杂脱色，再使用超滤技术得到酶液浓缩液，再将酶液浓缩液与赋形剂剂混合后喷雾干燥制得酶粉制剂。该方法操作工艺简单，成本低，生产效率高，产品品性好，适用于工业化大规模生产。

2、本发明采取以下技术方案：

3、本发明提供了一种制备淀粉分支酶干粉制剂的制备方法，包括如下步骤：

4、(1)枯草芽孢杆菌发酵生产的淀粉分支酶；

5、(2)将步骤(1)中获得的发酵液经过冷冻高速离心除菌得到粗酶液，离心温度为4℃，离心速率为10000r/min，离心时间20min；

6、(3)向步骤(2)得到的淀粉分支酶粗酶液中加入质量体积比为0.3％-0.8％的氯化钙，以300rpm-600rpm速率搅拌使其充分混合，后经过6000r/min离心10min除杂，收集上清液，此步骤可以有效去除一些粘性物质及部分杂蛋白，使粗酶液变得清澈；

7、(4)将(3)步骤得到的淀粉分支酶液加入0.5％-2％(w/v)的颗粒活性炭，置于30℃、200rpm的摇床中，吸附脱色0.5-2h后通过过滤网纱布将大颗粒活性炭去除，后抽滤通过0.2μm的滤膜，得到清澈透明的淀粉分支酶液；

8、(5)将步骤(4)得到的除杂脱色后的淀粉分支酶液超滤浓缩3-5倍得到浓缩酶液；

9、(6)向步骤(5)得到的浓缩酶液中添加一定比例的赋形剂进行喷雾干燥，即可得到淀粉分支酶干粉制剂。

10、在一种实施方式中，所述步骤(1)中枯草芽孢杆菌为利用来源于美洲红景天菌(rhodothermus obamensis)stb05的淀粉分支酶基因构建的工程菌。

11、在一种实施方式中，先添加氯化钙进行除杂脱色，后添加活性炭进行再脱色。

12、在一种实施方式中，粗酶液的浊度不小于60ntu，此时使用氯化钙除杂脱色效果佳。

13、在一种实施方式中，赋形剂为菊粉、黄原胶和乳清蛋白的复合物，浓度范围为菊粉15-20克/升、黄原胶0.3-1克/升和乳清蛋白3-8克/升，在加入浓缩酶液时需将菊粉、黄原胶和乳清蛋白的混合物一并加入后搅拌。

14、在一种实施方式中，喷雾干燥的条件为进风温度为120℃-160℃，出风温度为65℃-90℃，进料速度为4-12ml/min，风机频率在25-35hz，压力为0.15mpa-0.25mpa。

15、本发明还提供了任一所述方法制备得到的淀粉分支酶干粉制剂。

16、本发明还提供了任一所述方法在制备含淀粉分支酶的产品中的应用。

17、有益效果：

18、本发明用氯化钙和活性炭联用的方式处理淀粉分支酶酶液，使酶液的脱色率达到88.2％，酶活损失率控制在5％以内，起到协同促进的效果。

19、本发明所制备的固体粉末状淀粉分支酶产品酶活回收率高(可达99.29％，酶活为27.3u/mg)、品质好(白色或淡黄色颗粒状，水分含量在7％以下，易崩解)、储藏稳定性好(储存6个月水分含量低于7％、酶活损失低于10％)，其生产工艺简单，尤其提高了除杂脱色效率，易于在酶制剂生产企业中推广，且其制备过程中无有毒有害物质的加入，可应用于食品、医药、化工领域。本发明对淀粉分支酶酶制剂的广泛应用和发展具有重大意义。

技术特征：

1.一种淀粉分支酶干粉制剂的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中所述淀粉分支酶粗酶液的浊度不小于60ntu。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中所述粗酶液中，氯化钙的终浓度为0.3-0.8g/100ml。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中所述上清液中，活性炭的终浓度为0.5-2g/100ml。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中所述搅拌的转速为300rpm-600rpm。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)所述的干燥为喷雾干燥。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述喷雾干燥的条件为进风温度120℃-160℃，出风温度65℃-90℃，进料速度4-12ml/min，风机频率25-35hz，压力0.15mpa-0.25mpa。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，喷雾干燥中，还添加赋形剂，所述赋形剂包括15-20克/升菊粉、0.3-1克/升黄原胶和3-8克/升乳清蛋白。

9.权利要求1-8任一所述方法制备得到的淀粉分支酶干粉制剂。

10.权利要求1-8任一所述方法在制备含淀粉分支酶的产品中的应用。

技术总结
本发明公开了一种淀粉分支酶干粉制剂的制备方法，属于酶制剂技术领域。本发明提供了一种淀粉分支酶的干粉酶制剂的制备方法，主要步骤包括发酵液除菌、氯化钙和活性炭除杂脱色、超滤浓缩和喷雾干燥，以菊粉、黄原胶和乳清蛋白为赋形剂，制备的固体粉末状淀粉分支酶产品呈淡黄色、单位酶活高、储藏稳定性好。该工艺能有效提高工业生产中除杂脱色效率，易于在酶制剂生产企业中推广，且其制备过程中无有毒有害物质的加入，制备的淀粉分支酶干粉制剂可应用于食品、医药、化工领域。本发明对淀粉分支酶酶制剂的广泛应用和发展具有重大意义。

技术研发人员：李兆丰,李树,李才明,顾正彪,班宵逢,程力,洪雁
受保护的技术使用者：江南大学
技术研发日：
技术公布日：2024/4/7