一种同时制备、分离叶蛋白与糖蛋白的方法

本发明涉及一种同时制备、分离叶蛋白与糖蛋白的方法，属于植物叶蛋白深加工技术研究领域。

背景技术：

1、植物提取得到的糖蛋白是一类富含糖基的天然蛋白质，其背后蕴含着丰富的生物活性成分和潜在的医学、保健和美容应用。植物作为生物资源的独特性质使其成为糖蛋白的重要来源。植物提取得到的糖蛋白具有天然、绿色的特点，其来源于自然界的植物资源，更贴近人体生理特征。研究者通过深入挖掘不同植物的糖蛋白组成，探索其在调节免疫系统、抗氧化、抗炎、抗衰老等方面的作用机制，为未来开发植物提取糖蛋白的应用产品提供了坚实的科学基础。

2、植物组织中富含的细胞壁、细胞膜以及细胞质等部位含有丰富的蛋白质，并且这些蛋白质往往与糖基结合，形成糖蛋白的结构。这种天然的糖蛋白结构不仅赋予其特殊的生物活性，同时也在功能性食品、保健品和美容产品等领域中展现了广泛的应用前景。糖蛋白在活性和功能上的区别主要表现在其糖基的生物学活性上，这赋予了糖蛋白诸多独特的生物学功能。在制备产品时，从植物蛋白中提取的糖蛋白常被广泛应用于医学、保健和美容产品等领域。由于其天然来源、抗氧化性质以及细胞调节的功能，糖蛋白成为制备功能性食品、保健品和美容品的理想成分。这些产品可能涉及抗衰老、免疫调节、皮肤护理等多个方面，为植物蛋白的应用拓展了新的可能性，同时也促进了对糖蛋白与植物蛋白相互作用机制的深入研究。

3、从植物蛋白中分离糖蛋白是困难的，主要因为植物组织中存在多种不同的蛋白质，而糖蛋白只是其中的一小部分。其难度在于需要高效的技术手段来选择性地提取并纯化这一类蛋白，而不影响其他蛋白的完整性。由于植物蛋白种类繁多、结构复杂，分离出纯度较高的糖蛋白常常需要结合多种生物化学和分离技术，如柱层析、葡聚糖凝胶等，使其成为一项复杂而耗时的工作。

4、专利cn110343156b公开了从黑豆糖蛋白的提取纯化方法，采用水提醇沉，再使用deae 52纤维素离子柱层析初步分离，葡聚糖凝胶柱g 100纯化。专利cn111171126a公开了薏苡仁糖蛋白的提取方法，同样是采用水提醇沉，并辅助sevage试剂去除游离蛋白，透析纯化。专利cn115232191a公开了一种具有抗氧化活性党参糖蛋白的提取方法，采用tris hcl缓冲液提取，sevage试剂去除游离蛋白，硫酸铵沉淀去多糖的方法去除杂质。专利cn103554237b公开了一种从马齿苋中提取的活性糖蛋白及其制备方法，采用的是nacl提取，超滤浓缩，乙醇沉淀的方式。上述方法提取糖蛋白耗费得得试剂量较大，得率低，不易在低成本的条件下实现工业化生产。

5、因此，亟需开发一种能够高效制备、分离糖蛋白，同时也能够减少植物中其他蛋白损失的方法，该方法能够广泛应用于食品领域，具有极高经济价值和应用价值。

技术实现思路

1、为解决上述问题，本发明在粉碎植物叶片后加入等静压流高压釜高压提取，使用超速离心去除草渣与叶绿素，经聚四氟乙烯膜(ptfe)亲水复合膜过滤，采用树脂纯化植物叶片中的蛋白，通过不同的乙醇水溶液浓度进行洗脱，同时制备得到糖蛋白洗脱液与叶蛋白洗脱液，再经过浓缩干燥分别得到糖蛋白与叶蛋白。本发明的方法实现对植物叶片中的糖蛋白和叶蛋白的同时制备与分离，提高了蛋白的制备与分离效率，适用于工业化生产。

2、食叶草又名食叶菜，食叶草中的蛋白质含量高、氨基酸种类齐全。

3、本发明的第一个目的是提供一种制备分离糖蛋白与叶蛋白的方法，包括如下步骤：

4、s1原料预处理：加入焦亚硫酸钠和cacl2·2h2o粉碎植物叶片，高压均质得到草浆；

5、s2高压提取：将草浆加入等静压流高压釜高压提取，得到处理后的草浆；

6、s3去除叶绿素：将草浆于15000～17000r/min超速离心60～90min，得到草汁；

7、s4微滤：使用聚四氟乙烯膜亲水复合膜将草汁进行过滤，过滤压力0.05～0.2mpa，得到过滤后的草汁；

8、s5树脂纯化：使用树脂进行吸附过滤后的草汁，先采用20～25％v/v的乙醇水溶液洗脱，收集糖蛋白洗脱液，再采用65～75％v/v的乙醇水溶液洗脱收集洗脱，收集叶蛋白洗脱液；

9、s6旋转错流速式膜分离：分别对糖蛋白洗脱液和叶蛋白洗脱液进行超滤，得到糖蛋白浓缩液和叶蛋白浓缩液；

10、s7干燥：将糖蛋白浓缩液和叶蛋白浓缩液分别进行干燥，分别得到叶蛋白和糖蛋白。

11、在一种实施方式中，s1中植物叶片为食叶草。

12、在一种实施方式中，s1中使用湿法粉碎，粉碎后草渣的细度为80～120目。

13、在一种实施方式中，s1中焦亚硫酸钠、cacl2·2h2o、植物叶片的用量比为1.0～2.0g：100～200mm：1kg。

14、在一种实施方式中，s2中等静压流高压釜的反应条件为500～600mpa下，50～60℃下高压提取40～50min。

15、在一种实施方式中，s4中ptfe亲水复合膜的孔径为0.2～1μm。

16、在一种实施方式中，s4中超滤控制温度不超过30℃，压力为0.03～0.6mpa。

17、在一种实施方式中，s5中草汁与树脂按照质量比1：(0.5～10)；吸附流速为1bv/h，吸附后先采用20～25％v/v的乙醇水溶液洗脱2～3bv，解析流速为1bv/h，收集洗脱液得到糖蛋白；再采用65～75％v/v的乙醇水溶液洗脱2～3bv，解析流速1bv/h，收集洗脱液得到叶蛋白。bv代表柱体积。

18、在一种实施方式中，s6中超滤膜的孔径大小为0.01～0.1μm。

19、在一种实施方式中，s6中超滤的压力为0.01～0.1mpa，抽停比为(8～9)：(1～2)，即抽滤8～9分钟暂停1～2分钟；超滤膜分离转盘转速为10～20r/min；超滤膜材质为聚偏二氟乙烯(pvdf)或者ptfe。

20、本发明的第二个目的是提供任一上述方法制备得到的糖蛋白。

21、本发明还提供一种组合物，所述组合物含有上述糖蛋白。

22、本发明还提供上述糖蛋白或上述组合物在制备蛋白产品中的应用。

23、在一种实施方式中，所述蛋白产品为食品、保健品或药物。

24、在一种实施方式中，所述蛋白产品为蛋白补充剂、饲料或食品添加剂。

25、在一种实施方式中，所述蛋白产品至少具备如下一种功能：

26、(a)抗氧化；

27、(b)调节免疫力；

28、(c)抗炎。

29、本发明的第三个目的是提供一种提高植物源糖蛋白抗氧化性的方法，其特征在于，包括如下步骤：

30、s1原料预处理：将焦亚硫酸钠、cacl2·2h2o、植物叶片混合粉碎，高压均质，得到草浆；

31、s2高压提取：将草浆加入等静压流高压釜进行高压提取，得到处理后的草浆；

32、s3去除叶绿素：将处理后的草浆于15000～17000r/min下超速离心60～90min，得到草汁；

33、s4微滤：使用聚四氟乙烯膜亲水复合膜将草汁进行过滤，得到过滤后的草汁；

34、s5树脂纯化：过滤后的草汁使用树脂进行吸附；吸附后先采用浓度为20～25％v/v的乙醇水溶液洗脱，收集糖蛋白洗脱液；再采用65～75％v/v的乙醇水溶液洗脱，收集叶蛋白洗脱液；

35、s6旋转错流式膜分离：分别将糖蛋白洗脱液和叶蛋白洗脱液进行超滤，得到糖蛋白浓缩液和叶蛋白浓缩液；

36、s7干燥：将糖蛋白浓缩液和叶蛋白浓缩液分别进行干燥，得到叶蛋白和抗氧化性好的糖蛋白。

37、有益效果

38、本发明在粉碎植物叶片后加入等静压流高压釜反应，使用超速离心去除草渣与叶绿素，经ptfe亲水复合膜过滤，采用树脂纯化植物叶片中的蛋白，通过不同浓度的乙醇水溶液进行洗脱，同时制备得到糖蛋白与叶蛋白，再经过浓缩干燥分别得到糖蛋白与叶蛋白。

39、本发明的糖蛋白与叶蛋白具有如下优势：

40、(1)本发明未采用有机试剂乙醇或者sevage试剂进行糖蛋白的提取，只在蛋白浓缩分离时使用低浓度的乙醇水溶液，减少了试剂的损耗和对环境的影响；

41、(2)本发明通过超滤和树脂结合的方式实现了对糖蛋白的纯化，两者均适用于工业化生产，且成本相对较低，树脂可回收；

42、(3)本发明制备得到的糖蛋白和叶蛋白纯度和得率高，颜色较浅；具体的，糖蛋白的得率达到13.1％以上，纯度76.9％以上，叶蛋白的得率达到67.4％以上，纯度85.2％以上，蛋白总得率达到75.1％以上；

43、(4)本发明制备得到的糖蛋白和叶蛋白纯度和得率高，颜色较浅；具体的，糖蛋白得率达到12.5％以上，纯度达到76.9％以上，同时制备分离得到叶蛋白，得率达到64.3％以上，纯度达到85.0％以上，总得率达到77.1％以上。