一种炭疽病菌高通量检测引物及定性定量检测方法

本发明涉及分子生物学，尤其涉及ipc c12q1，更具体地涉及，一种炭疽病菌高通量检测引物及定性定量检测方法。

背景技术：

1、草莓炭疽病是草莓苗期的主要病害之一，危害草莓的匍匐茎、叶柄、叶片、托叶、花瓣、花萼和果实。草莓炭疽病菌容易潜伏侵染，连作地发病重，老残叶多、植株徒长、栽植过密、通风不良时易发病，植株发病容易造成大量的经济损失。随着草莓种植面积的扩大，草莓上的病害也得到了越来越多的关注，其中草莓根腐病最严重，由刺盘孢属、镰刀菌属、丝核菌属、疫霉菌属等多种病原菌引起。

2、现有的草莓炭疽病的防治方法通常通过化学药物手段进行病害防控，但随着炭疽病菌抗药性的不断增强，杀菌剂防治的效果不太理想，因此，草莓炭疽病的防治还需尽早在幼苗期发现，避免其传播为主。

3、现有专利cn201810021523.2公开了一种苗期草莓炭疽病潜伏侵染及其用药的快速检测法，“采用该方法能特异性检测出对qoi类杀菌剂高抗的草莓胶孢炭疽菌”；“而其他刺盘孢如黑色刺盘孢、平头炭疽菌和辣椒炭疽病菌均呈阴性反应”。但是，引起草莓炭疽病的病原菌至少有四种，包括果生炭疽病菌(colletotrichum fructicola)、暹罗炭疽病菌(c.siamense)、隐秘炭疽病菌(c.aenigma)和胶孢炭疽病菌(c.gloeosporioides)。因地域的不同，草莓炭疽病菌优势致病菌种类也不同；同时，同一株草莓幼苗可能存在上述的两种致病菌，引起复合侵染。由于草莓炭疽病菌存在潜伏侵染，但是，从外观上，带(炭疽病)菌苗与无菌苗一样，无法依赖目测进行甄别。一旦移栽带病苗，会在移栽的15天左右死亡，给种植户带来巨大损失。草莓幼苗的提供者也迫切需要能够对待售的草莓幼苗进行“体检”，以免客户“流失”和改进防控措施，培育无病壮苗。另一方面，草莓种植户也迫切需要一种技术，明确所购买的幼苗是否带菌。

4、因此，需要开发草莓炭疽病菌复合致病种的高通量的定量定性检测方法，辨别草莓幼苗是否携带炭疽病原菌，从而指导草莓炭疽病的科学防控。

技术实现思路

1、为了解决现有技术中的问题，本发明一方面提供了一种炭疽病菌高通量检测引物，包括上游引物q-itsf和下游引物q-itsr，所述q-itsf的引物序列为seq id no：1：tgatgtaggccctcaaaggtagcgg；所述q-itsr的引物序列为seq id no：2：attgggggttttacggcaagagagc(由上海生工生物工程有限公司)。

2、优选的，所述炭疽病菌高通量检测引物筛选方法：通过bioedit和mega 7.0.18软件对炭疽病菌和非炭疽病菌进行基因分析，prime5设计特异性引物，进行pcr验证，得到炭疽病菌高通量检测引物。

3、本发明中，设计特异性上游引物q-itsf和下游引物q-itsr，能够特异性识别炭疽病菌，不识别非炭疽病菌，同时，对多种不同种类的炭疽病菌均有识别作用。本发明人创造性的选择了6种阴性对照菌和6种阳性对照进行序列比对，发现c.siamense jr-1菌株的its序列在402bp-517bp与阳性对照菌株序列基本一致，而阴性对照序列出现了明显的不同，因此，研究选择了这段序列，花费了大量的时间和精力，在一定偶然因素的作用下，设计上游引物q-itsf和下游引物q-itsr，达到特异性识别的能力和高灵敏度，在常规pcr中最低检测限在1ng/μl，基因拷贝数达到3.8×1010/ul，而qpcr最低检测限在10pg/μl，基因拷贝数达到3.8×108/ul，是常规pcr灵敏度的100倍。

4、优选的，所述炭疽病菌包括刺盘孢属、镰刀菌属、腐霉菌属、葡萄孢属中的一种或多种。进一步优选的，所述炭疽病菌包括果生炭疽病菌(colletotrichum fructicola)、暹罗炭疽病菌(c.siamense)、隐秘炭疽病菌(c.aenigma)和胶孢炭疽病菌(c.gloeosporioides)、平头炭疽病菌(c.truncatum)、尖孢炭疽病菌(c.acutatum)。

5、优选的，所述炭疽病菌的数量为6种，所述非炭疽病菌的数量为6种。

6、优选的，所述6种炭疽病菌和6种非炭疽病菌的菌种基因信息见表1。

7、表1供试菌株

8、

9、

10、本发明中，通过特异性引物，可以同时鉴别出多种炭疽，所以适用范围广泛，即：胶孢炭疽病菌、尖孢炭疽病菌、果生炭疽病菌、平头炭疽病菌、暹罗炭疽病菌、隐秘炭疽病菌等多种炭疽菌都可以应用该检测体系。一般的炭疽病菌高通量定性定量检测中，只能检测出一种炭疽病菌，无法检测其它炭疽病菌，本发明中建立多种炭疽病菌的检测方法，能同时检测出6种炭疽病菌，筛选出草莓病植株上的炭疽菌概率增大，同时也降低了筛选成本。

11、本发明第二方面提供了一种炭疽病菌高通量定性定量检测方法，包括以下步骤：

12、s1：用基因组提取试剂盒提取草莓样本的dna；

13、s2：将标准样品和草莓样本进行常规pcr和qpcr检测，判断样本中的dna是否是炭疽菌，并定量检测炭疽菌的含量。

14、优选的，所述基因组提取试剂盒为天根植物基因组dna提取试剂盒，具体操作按试剂盒说明书进行。

15、优选的，所述s2中的具体步骤包括：对标准样品c.siamense jr-1菌株基因组进行qpcr扩增，配制标准样品初始浓度的初始浓度为1×106pg/μl、1×105pg/μl、1×104pg/μl、1×103pg/μl、1×102pg/μl、10pg/μl，分别取1μl为模板进行常规pcr反应(凝胶电泳法)与实时荧光定量pcr得到相应的ct值；绘制标椎曲线；然后，将草莓样品和标准菌株的dna模板进行常规pcr反应，1％琼脂糖电泳验证，然后利用qpcr测得样品ct值，然后代入标准曲线，求出草莓病植株携带炭疽菌的菌量。

16、优选的，所述标准菌株的dna模板是通过采用ctab法粗提供试菌株c.siamensejr-1的dna得到的。

17、优选的，所述供试菌株c.siamense jr-1由南京农业大学植物保护学院分离鉴定田间植株得到。

18、优选的，所述ctab法的具体步骤如下：

19、1)配pda培养基，高温灭菌，接种需要提取dna的菌。配ctab提取液(0.1mol/ltris-hcl，ph7.5；1％ctab：0.7mol/lnacl；10mmol/l edta)高温菌，实验时加入1％2-疏基醇)。

20、2)pda培养适当时间，将菌体导入10m1离心管12000转离心3min，滤纸吸水。吸除绝大部分水分。

21、3)在研钵中加入液氮，研磨至粉末。

22、4)加入预热的ctab 10ml，轻柔的颠倒混，65℃水浴1h(每隔10min摇一次)，室温12000rpm，10min，吸取上清。

23、5)加入等体积的氯仿：异戊醇(24：1)，12000rpm，5min，取上清。

24、6)加入等体积的氯仿：异戊醇(24：1)，12000rpm，5min，离心后取上清液。

25、7)加入异丙醇(等体积)，-20℃冰箱沉淀1h。12000rpm，10min离心后，去上清。

26、8)70％乙醇洗涤，室温干燥10min。

27、9)加入适量已灭菌的重蒸水溶解，-20℃保存，备用。

28、优选的，常规pcr反应体系包括无菌水ddh2o：上游引物q-itsf：下游引物q-itsr：模板dna：2×taq master mix的体积比为(7～13)：(0.8～1.2)：(0.8～1.2)：1：(10～15)。

29、进一步优选的，常规pcr反应体系(2xtaq master mix购自诺维赞生物有限公司，其中含有taq dna polymerase、dntp和优化的缓冲体系)见表2。

30、表2

31、

32、优选的，所述常规pcr反应程序：95℃预变性5min；95℃变性30s，59℃退火30s，72℃延伸9s(每1000bp dna链长对应30s)，35个循环；72℃延伸7min。

33、优选的，所述时荧光定量pcr反应体系中包括引物体系和dna模板体系。

34、优选的，所述引物体系中包括2×chamq sybr qpcr master mix、无菌水ddh2o、上游引物q-itsf、下游引物q-itsr；其中2×chamq sybr qpcr master mix：无菌水ddh2o：上游引物q-itsf：下游引物q-itsr体系比为(1.1～1.4)：(8～12)：(0.8～1.2)：1。

35、优选的，所述dna模板体系中包括2×chamq sybr qpcr master mix、无菌水ddh2o、模板dna、50×rox reference dye 2的体系比为(4～5)：(3～5)：1：(0.3～0.5)。

36、进一步优选的，所述的实时荧光定量pcr反应体系(“chamq sybr qpcr mastermix q311”试剂盒购自诺维赞生物有限公司，本产品是使用sybr gren l嵌合荧光法进行qpcr反应的专用预混液。)见表3。

37、表3

38、

39、优选的，所述实时荧光定量pcr的反应程序包括预变形、循环反应和溶解曲线。

40、进一步优选的，所述实时荧光定量pcr的反应程序见表4。

41、表4

42、

43、有益效果

44、1、本发明中，通过测定c.siamense模板的起始浓度和ct值，建立了ct值与模板起始浓度对数值之间的关系，绘制出了标准曲线，利用该检测体系，可以快速鉴别出草莓病植株上的炭疽菌，提高病害调查的效率。也可以精准计算出每株草莓病植株上的带菌量，从而指导选种育种工作，从源头切断病原菌的传播。

45、2、本发明中，设计特异性上游引物q-itsf和下游引物q-itsr，能够特异性识别炭疽病菌，不识别非炭疽病菌，同时，对6种不同种类的炭疽病菌均有识别作用。

46、3、本发明中的特异性引物，可以同时鉴别出多种炭疽，所以适用范围广泛，即：胶孢炭疽病菌、尖孢炭疽病菌、果生炭疽病菌、平头炭疽病菌、暹罗炭疽病菌、隐秘炭疽病菌6种炭疽菌都可以应用该检测体系。

47、4、本发明中的高通量定性定量检测方法与炭疽菌的lamp检测技术相比适用性更广，更经济，准确度更高。

48、5、本发明中，田间采集的草莓病植株验证了引物特异性良好，说明该方法体系可以适用于田间监测，且本发明中还发现了不同部位带菌量存在显著差异，这应该和该病是从根部向上传染有极大的关系，所以选用药剂时，要选用能下向传导的，从源头切断病原的传播。