一种端基修饰的阳离子聚酯、活体递送体系及应用的制作方法

本技术涉及核酸递送材料，特别是涉及一种端基修饰的阳离子聚酯、活体递送体系及应用。

背景技术：

1、相较于dna或病毒载体等其它技术，mrna技术具有高效性、安全性高、生产周期更短、生产成本更低等优势。然而，由于mrna分子的不稳定性及体内递送效率低等原因，mrna技术的应用一直受到限制。要实现mrna技术的广泛应用，就需要有合适的递送载体将其递送至体内，才能有可实用的效果。目前商业化成功的递送技术主要是moderna和biotech等公司所用的基于可电离阳离子脂质的脂质纳米粒(lnp)技术。虽然lnp已被广泛用于新冠疫苗，然而其相对低效率和显著副作用，极大的限制其应用范围。因此开发高效无毒的活体递送系统依然是抑制mrna技术发展的瓶颈问题。

2、百达联康生物科技(深圳)有限公司在美国耶鲁大学报道的一种可用于dna和mrna递送的生物可降解阳离子聚酯的基础上研发了一种新的可用于dna和mrna递送的生物可降解的超支化阳离子聚酯。采用该超支化阳离子聚酯进行基因递送，其效率显著优于线性聚合物及现有最佳商用mrna转染试剂，且细胞毒性更低。另外该超支化阳离子聚酯可溶于乙醇，具有潜在的临床应用潜力。然而，深入研究发现，超支化阳离子聚酯与基因药物形成的复合物具有高效的体外细胞水平的基因递送效率，但这种复合物在进行活体递送时效率显著降低。

3、因此，如何提高超支化阳离子聚酯与基因药物形成的复合物的活体递送效率是亟待解决的重要技术问题。

技术实现思路

1、本技术的目的是提供一种改进的端基修饰的阳离子聚酯、活体递送体系及应用。

2、为了实现上述目的，本技术采用了以下技术方案：

3、本技术的第一方面公开了一种端基修饰的阳离子聚酯，该阳离子聚酯为单体p、单体s和单体m三种单体，或者单体p和单体s两种单体，与单体t聚合形成的超支化聚合物(缩写hbpa)，并且超支化聚合物的端羧基具有聚乙二醇(缩写peg)修饰；其中，单体p为环内酯；单体s为端基含有两个或两个以上羧基的有机酸；单体m为含有两个羟基，以及一个仲胺或叔胺的化合物；单体t为含有三个或三个以上羟基的化合物；聚乙二醇的数均分子量为0.4～20k。

4、需要说明的是，本技术人之前研发了一种超支化聚合物的端基具有基团e修饰的阳离子聚酯(缩写hbpa-e)，提供基团e修饰的端基修饰化合物e为至少含有一个伯胺、仲胺或叔胺基团的化合物。虽然hbpa-e具有较高的体外转染效率；但是，在进行活体递送时效率显著降低。分析认为，hbpa-e与核酸药物形成的复合物因其表面显著带正电，从而导致其在进行活体递送时效率显著降低。因此，本技术研发了一种新的端基修饰的阳离子聚酯，即端羧基peg修饰的阳离子聚酯(缩写hbpa-peg)。本技术的hbpa-peg，一方面，peg修饰能够消耗部分羧基，使得超支化聚合物的电性更趋于中性；另一方面，peg修饰后具有更好的稳定性，并且，peg具有亲水性，与hbpa-e联合使用，进行活体递送时，peg在与核酸药物形成的复合物表面形成稳定结构，增强活体递送体系的稳定性，从而显著提高核酸药物的活体递送效率，解决了端基基团e修饰的阳离子聚酯在进行活体递送时效率显著降低的问题。

5、还需要说明的是，本技术的关键在于利用peg修饰提高hbpa-peg以及hbpa-peg和hbpa-e组成的活体递送体系的稳定性；但是，单纯的peg修饰的hbpa-peg核酸递送效率并不好，尤其是随着peg分子量的增加，虽然稳定性会提升，但是会影响递送效率；因此，本技术优选采用0.4～20k的peg，更优选的，例如采用1～5k的peg。

6、本技术的一种实现方式中，单体p为脂肪链长度6至35的环内酯。

7、本技术的一种实现方式中，单体p选自但不仅限于环己内酯、环十二烷内酯、环十五烷内酯和环十六烷内酯中的至少一种。

8、本技术的一种实现方式中，单体s为碳链长度3至18的有机酸。

9、本技术的一种实现方式中，单体s选自但不仅限于己二酸、癸二酸和1,2,3-丙烷三甲酸中的至少一种。

10、本技术的一种实现方式中，单体m为碳链长度4至36的含有两个羟基，以及一个仲胺或叔胺的化合物。

11、本技术的一种实现方式中，单体m选自但不仅限于二乙醇胺、甲基二乙醇胺和乙基二乙醇胺中的至少一种。

12、本技术的一种实现方式中，单体t为碳链长度4至54的含有三个或三个以上羟基的化合物。

13、本技术的一种实现方式中，单体t选自但不仅限于三羟甲基丙烷、3-(羟甲基)-1,5-戊二醇、三乙醇胺、n,n,n’,n’-四羟乙基乙二胺中的至少一种。

14、本技术的一种实现方式中，聚乙二醇与超支化聚合物的摩尔比为5:1～1:10。

15、需要说明的是，聚乙二醇与超支化聚合物的摩尔比实际上体现的是超支化聚合物端羧基被peg修饰的数量或程度。可以理解，hbpa具有超分支结构，具有多个端羧基，在peg分子量相同的情况下，端羧基被peg修饰的数量越多，hbpa-peg的稳定性越高，但是递送效率越低；在这种情况下，相应的在hbpa-peg和hbpa-e组成的活体递送体系中，hbpa-peg就需要减少占比。因此，聚乙二醇与超支化聚合物的摩尔比可以为一个较大的范围，例如5:1～1:10。总的来说，无论是peg的分子量，还是peg的端羧基修饰数量，都以最终hbpa-peg和hbpa-e组成的活体递送体系在活体递送时的效率为准；原则上，如果hbpa-peg中peg的分子量越大，和/或peg的端羧基修饰数量越多，则活体递送体系中hbpa-peg的用量相对越少，这样才能够即保障hbpa-peg、hbpa-e和核酸药物形成的组合物具有更好的稳定性，又具有良好的递送效率，进而具有更高的活体递送效率。

16、本技术的一种实现方式中，阳离子聚酯的数均分子量为1-30k，优选为2-20k。

17、本技术的一种实现方式中，超支化聚合物的端羧基还具有中性化合物封端和/或基团e修饰，其中，提供基团e修饰的端基修饰化合物e为至少含有一个伯胺、仲胺或叔胺基团的化合物。

18、需要说明的是，peg修饰只能对超支化聚合物的部分羧基进行封端，剩余的没有封端的羧基使hbpa-peg的电性仍然为负电。在与核酸药物形成复合物的过程中，核酸药物的电性为负电，与带正电的hbpa-e相互吸引形成复合物；因此，如果hbpa-peg的电性为负电，会对hbpa-e或其他带正电的脂质造成不必要的损失。基于这样的考虑，本技术的进一步改进方案中，对进行peg修饰的端羧基以外的其余羧基，都进行中性化合物封端和/或基团e修饰。

19、本技术中，对于其余羧基的封端可以采用本领域常规使用的小分子聚合物，例如分子量小于1000的聚合物，包括但不仅限于伯胺化合物、醇类化合物和环氧化合物等。这些小分子聚合物仅仅是对羧基进行封端，使得hbpa-peg的电性从负电变为中性；因此，本技术将其统一称为中性化合物或中性化合物封端。基团e修饰，实际上就是hbpa-e中的端基修饰方式；因此，基团e修饰能够使hbpa-peg带正电。这种情况下，带正电的hbpa-peg不仅能够具有更好的稳定性，还能够与核酸药物相互吸引，起到部分hbpa-e的功能，从而使得活体递送体系具有更高的递送效率。本技术研究证实，无论是中性化合物封端，还是基团e修饰，只要对其余羧基有进行封端，其活体递送效率都优于没有进行封端的hbpa-peg。

20、本技术的一种实现方式中，中性化合物包括伯胺化合物、醇类化合物和环氧化合物中的至少一种。

21、本技术的一种实现方式中，伯胺化合物为含有一个伯胺的分子量小于1000的小分子化合物。

22、本技术的一种实现方式中，伯胺化合物为乙胺、丙胺、丁胺、乙醇胺和正丙醇胺等中的至少一种。

23、本技术的一种实现方式中，醇类化合物为乙醇、丙醇和丁醇中的至少一种。

24、本技术的一种实现方式中，对hbpa-peg的其余羧基进行修饰的端基修饰化合物e为e1至e26中的至少一种；优选的，端基修饰化合物e为e1至e10、e12、e14至e21、e25、e26中的至少一种；更优选的，端基修饰化合物e为e2、e4、e9、e10、e12、e14、e15、e25、e26中的至少一种。

25、本技术的一种实现方式中，阳离子聚酯为式一所示结构的超支化聚合物；

26、式一

27、

28、其中，x、y、z为1至200的独立整数，

29、n为0至200的整数，

30、j、k为0至30的整数，

31、l、m、o、p、q为1至20的独立整数，

32、rx为氢，或者取代或未取代的含1-18个碳原子的烷基，或者取代或未取代的含至少1个苯环的芳香基，或者取代或未取代的含至少1个杂环的杂环基，或者取代或未取代的含1-18个碳原子及至少1个氧原子的烷氧基；

33、j为氢，r1中至少一个为聚乙二醇修饰形成的基团，其它为中性化合物封端形成的基团或端基修饰化合物e提供的基团e修饰，此时没有r2；或者，j为羰基，此时r1和r2中至少一个为聚乙二醇修饰形成的基团，其它为中性化合物封端形成的基团或端基修饰化合物e提供的基团e修饰；

34、式一中，截断线表示分支结构，分支结构连接的第一个单体为p或s，后续连接其他单体形成超支化结构。

35、其中，连接其他单体是指，例如，后续按照式一的顺序连接单体，在分支结构的基础上再形成支化结构，如此循环，形成类似树枝状的超支化结构。

36、需要说明的是，本技术中，在只有单体p、s与单体t聚合形成超支化聚合物时，即n为0，此时j如果为羰基，羰基一端连接r2，另一端连接单体t的羟基。可以理解，这种情况下，式一通式的结构会适应性的调整，即单体t在末端，与羰基j相连。

37、本技术的第二方面公开了一种活体递送体系，其包括第一聚合物和第二聚合物；第一聚合物为本技术的阳离子聚酯；第二聚合物为超支化聚合物的端基具有基团e修饰的聚合物，即端基基团e修饰阳离子聚酯，其中，提供基团e修饰的端基修饰化合物e为至少含有一个伯胺、仲胺或叔胺基团的化合物。

38、需要说明的是，本技术的活体递送体系，即用于活体递送的基因递送材料，主要由本技术的hbpa-peg和之前研发的hbpa-e组成，两者组合能够显著提高活体递送效率，解决单独使用端基基团e修饰的阳离子聚酯在进行活体递送时效率显著降低的问题。分析认为，本技术的活体递送体系与核酸药物形成复合物时，hbpa-peg中的peg具有亲水性，会在复合物的表面形成稳定结构，提高活体递送过程中复合物的整体稳定性，从而提高活体递送的效率。

39、本技术中，第二聚合物hbpa-e的端基基团e修饰阳离子聚酯的端基修饰化合物e为e1至e26中的至少一种。

40、优选的，端基修饰化合物e为e1至e10、e12、e14至e21、e25、e26中的至少一种。

41、更优选的，端基修饰化合物e为e2、e4、e9、e10、e12、e14、e15、e25、e26中的至少一种。

42、需要说明的是，本技术采用端基修饰化合物e1至e26进行端基修饰获得的端基基团e修饰阳离子聚酯都具有较好的转染效率和较低的细胞毒性；尤其是，e2、e4、e9、e10、e12、e14、e15、e25、e26端基修饰获得的端基基团e修饰阳离子聚酯转染效率明显优于其他端基修饰的阳离子聚酯，也明显优于当前效率最高的商业转染试剂lipomm。

43、本技术的一种实现方式中，第二聚合物，即端基基团e修饰阳离子聚酯，为式二所示结构的超支化聚合物；

44、式二

45、

46、其中，x、y、z为1至200的独立整数，

47、n为0至200的整数，

48、j、k为0至30的整数，

49、l、m、o、p、q为1至20的独立整数，

50、rx为氢，或者取代或未取代的含1-18个碳原子的烷基，或者取代或未取代的含至少1个苯环的芳香基，或者取代或未取代的含至少1个杂环的杂环基，或者取代或未取代的含1-18个碳原子及至少1个氧原子的烷氧基；

51、j为氢，r1为端基修饰化合物e提供的基团e修饰，此时没有r2；或者，j为羰基，此时r1和r2两者都是端基修饰化合物e提供的基团e修饰；

52、式二中，截断线表示分支结构，分支结构连接的第一个单体为p或s，后续连接其他单体形成超支化结构。

53、需要说明的是，本技术中，hbpa-peg和hbpa-e，两者的主链，即超支化聚合物，其结构原理是相同的，只是端基修饰不同而已。当然，在活体递送体系中，hbpa-peg和hbpa-e，两者的具体数均分子量，或者单体的排列顺序可能有所不同。

54、本技术的一种实现方式中，第二聚合物的数均分子量为1-30k，优选为2-20k。

55、本技术的一种实现方式中，第一聚合物和第二聚合物的质量比为0.01:9.99～2.5:7.5。

56、需要说明的是，本技术的关键在于hbpa-peg和hbpa-e两者联合使用；可以理解，原则上，只要在hbpa-e中添加hbpa-peg都能不同程度的起到提高活体递送效率的效果；但是，本技术研究发现，第一聚合物和第二聚合物的质量比为0.01:9.99～2.5:7.5形成的活体递送体系，其活体递送效率相对较高。其中，第一聚合物hbpa-peg的用量太少，则递送体系在活体中不够稳定，从而导致递送效率降低；反之，如果第一聚合物hbpa-peg的用量太多，其细胞递送效率极低从而导致几乎没有活体递送效率。

57、本技术的第三方面公开了本技术的阳离子聚酯或本技术的活体递送体系在核酸药物递送中的应用。

58、本技术的一种实现方式中，核酸药物包括但不仅限于mrna、环状rna、sirna、microrna、sarna和dna。

59、需要说明的是，本技术的关键在于，改进了一种新的核酸药物递送材料，即本技术的阳离子聚酯hbpa-peg，能够解决单独使用端基基团e修饰阳离子聚酯进行活体递送的效率显著降低的问题。本技术的活体递送体系同样能够用于细胞转染，例如采用本技术的活体递送体系包裹核酸药物，将其递送到细胞内。这些细胞的种类包括但不限于hek293t、a549、hela、u87、huvec、jurkat、raw264.7、ipsc和msc。

60、本技术的第四方面公开了一种核酸递送颗粒，包括包裹材料和包裹于包裹材料内的核酸；包裹材料为本技术的阳离子聚酯或包裹材料中至少包含本技术的阳离子聚酯，又或者包裹材料为本技术的活体递送体系或包裹材料中至少包含本技术的活体递送体系；核酸为mrna、环状rna、sirna、microrna、sarna和dna中的至少一种。

61、需要说明的是，采用本技术活体递送体系的核酸递送颗粒，由于采用本技术的活体递送体系，不仅具有细胞毒性小、能更好满足临床使用需求等优点；还能够显著提高活体递送效率，解决单独使用端基基团e修饰的阳离子聚酯进行活体递送时的效率显著降低的问题。可以理解，本技术核酸递送颗粒的关键在于采用本技术的阳离子聚酯或本技术的活体递送体系，至于具体的包埋方法和核酸递送方法可以参考现有技术。

62、还需要说明的是，本技术的包裹材料可以根据包裹层的不同设计或需求，还包含本技术阳离子聚酯或本技术活体递送体系以外的其他材料，在此不作具体限定。

63、本技术的一种实现方式中，核酸递送颗粒的粒径为30-500nm。

64、本技术的第五方面公开了一种核酸药物递送的试剂盒，包括以下组分中的至少一种：

65、(a)本技术的阳离子聚酯；

66、(b)本技术的活体递送体系；

67、(b)本技术的核酸递送颗粒。

68、需要说明的是，本技术的核酸药物递送的试剂盒，可以是已经包埋好的某种特定核酸药物的试剂盒，也可以是本技术的阳离子聚酯或本技术的活体递送体系，使用者根据需求自行设计和包埋相应的核酸药物。可以理解，本技术试剂盒的关键在于含有本技术的阳离子聚酯、活体递送体系或核酸递送颗粒，至于核酸递送所需的其他常规试剂，例如一些脂质或聚合物材料等，可以参考现有技术或市售购买获得。当然，为了使用方便，也可以将部分试剂组合到本技术的试剂盒中，在此不作具体限定。

69、本技术的第六方面公开了本技术的阳离子聚酯，或者本技术的活体递送体系，或者本技术的核酸递送颗粒，或者本技术的试剂盒在基于核酸药物递送的疾病治疗中的应用。

70、本技术的第七方面公开了一种在体内施用核酸药物的方法，包括采用本技术的活体递送体系或者含有本技术活体递送体系的包裹材料，对核酸药物进行包裹，形成核酸递送颗粒，利用核酸递送颗粒进行核酸药物递送。

71、需要说明的是，本技术的施用方法，其关键在于采用本技术的活体递送体系进行核酸药物递送，至于体内递送的具体操作以及所需要的其他辅助材料，都可以参考现有技术，在此不作具体限定。

72、由于采用以上技术方案，本技术的有益效果在于：

73、本技术的阳离子聚酯，对超支化聚合物的端羧基进行聚乙二醇修饰，与端基基团e修饰的阳离子聚酯一起进行活体递送时，能够提高复合物的稳定性，从而显著提高活体递送效率。