本发明涉及结合cd3的全人抗体，包括其结构修饰的变体，该抗体与hla蛋白结合的可能性降低，因此一旦施用，在人类中引发免疫应答的风险降低。本发明还提供采用本文公开的cd3特异性抗体的双特异性抗体、生产此类抗体的方法以及使用它们治疗疾病(例如治疗癌症)的方法。
背景技术：
1、cd3(分化簇3)是一种蛋白质复合物，由至少四条不变的多肽链组成，这些多肽链与t细胞表面上的t细胞受体(tcr)非共价结合，通常称为cd3抗原复合物。抗原与t细胞受体结合后，cd3抗原复合物在t细胞活化中起重要作用。cd3已广泛探索为药物靶标。基于靶向cd3的双特异性抗体的治疗概念依赖于同时结合肿瘤细胞上的细胞表面抗原和细胞毒性t细胞上存在的cd3，目的是结合的细胞毒性t细胞直接杀伤肿瘤细胞(miller和kontermann,bispecific antibodies for cancer immunotherapy:current perspectives.biodrugs2010,24(2):89-98)。
2、cd3靶向疗法的一个主要问题在于其剂量限制毒性，这是由脱靶t细胞活化引起的。此类毒性基本上是由cd3抗体固有的刺激t细胞的能力驱动的，而不管靶细胞是否存在。事实上，在基于cd3的抗体疗法中观察到的许多副作用似乎与异常的t细胞功能有关，例如相关的细胞因子产生，这可能导致毒性细胞因子释放综合征。因此，为了降低此类毒性，目前已充分确定以单价方式与t细胞上存在的cd3结合，并使用缺乏与辅助细胞(例如单核细胞、b细胞和nk细胞)上的fc受体结合能力的抗体骨架。这种方法避免了t细胞上存在的cd3复合物的交联及其随后的活化。
3、本领域已描述了大量与cd3结合的抗体。这包括啮齿动物来源的抗体，例如okt-3(kung p.等人,science,1979oct 19；206(4416):347-9)或sp34(yoshino n.等人,exp.anim 49:97-110,2000；conrad ml.等人,cytometry 71a:925-33,2007)，以及其人源化衍生物。此外，在本领域中描述了大量从头生成的具有cd3特异性的人抗体或人源化抗体。由于其来源于鼠类，sp34或okt-3在非免疫抑制的人类中诱导强烈的人抗-鼠抗体(hama)免疫原性反应，这限制了它们的给药潜力，并且还可能引发危险的过敏反应。一般来说，此类免疫应答需要抗原呈递细胞(apc)吸收治疗性(外来)蛋白质(即治疗性抗体)。一旦进入此类细胞，蛋白质就被加工，并且蛋白质的释放片段(某些短肽序列与mhc ii类分子形成复合物)呈递在细胞表面上。如果此类复合物被t细胞上存在的t细胞受体结合识别，则此类细胞可被活化以产生刺激性细胞因子。细胞因子将引发b细胞分化为成熟的抗体生成细胞。此外，此类t细胞应答还可能对患者产生其他有害影响，例如炎症和可能的过敏反应。然而，据了解，某些被发现与mhc ii类分子结合的肽在最终蛋白质被施用到的生物体中被识别为“自身”，因此不引起免疫应答。例如，在人胚系免疫球蛋白可变区蛋白序列中发现了此类肽。
4、因此，设计了在人类中具有降低的免疫原性的人源化cd3特异性抗体。人源化过程的一个共同方面是引入与人抗体蛋白中存在的氨基酸序列具有同一性的大量氨基酸序列，因此涉及例如将非人抗体的cdr移植到最接近的人胚系受体抗体框架中。与人源化过程相关的一个显著缺点是所得人源化抗体的结合亲和力显著降低以及生产率和稳定性较差。恢复原始特性通常通过将人类残基回复突变为非人类供体抗体中相同位置处的氨基酸的迭代过程来实现。然而，此类回复突变可能再次增加在人类中诱发免疫原性反应的风险。
5、因此，使用人抗体似乎是克服使用鼠类或人源化抗体的上述缺点的理想解决方案，因为免疫应答通常不会对自体循环蛋白(autologous circulating protein)(例如免疫球蛋白)产生影响。但是，当施用于某些个体时，人抗体仍可能引发免疫应答或具有免疫原性。例如，从人噬菌体展示文库中选择的重组人抗体仍可能采用非胚系编码的蛋白质序列，例如来自人框架序列分析的共识(consensus)框架序列，这可能引发免疫反应。此外，cdr区域中引入的变异性(特别是在最初选择的抗体的亲和力成熟过程中)可能引起免疫反应。此类选定的cdr氨基酸序列可能与外来蛋白质相似，因此可以提供被认为通常不被免疫系统利用的表位。
6、如上所述，对于cd3靶向疗法，避免任何不必要的t细胞活化是最重要的。针对治疗性cd3特异性抗体的免疫反应可以恢复t细胞上二价或多价cd3结合和cd3复合物的不需要的交联，从而恢复它们的活化。因此，本发明主要采用一种新方法，提供优化的针对cd3特异性的全人抗体，其特征在于去除其亲本全人抗体对应物的cdr区中存在的潜在t细胞表位，因此一旦施用，在人类中引发免疫应答的风险降低。
技术实现思路
1、本公开提供亲和力优化的人cd3特异性抗体及其去免疫变体。亲和力优化的抗体在其互补决定区(cdr)中进行改变，以在施用后降低其在人类中的免疫原性或降低其在人类中引发免疫应答的风险。
2、在一个实施方式中，本公开提供分离的特异性针对分化簇3(cd3)的人抗体或其抗原结合片段，其包含
3、i.重链可变区(vh)，其包括
4、(a)包含氨基酸序列gfsfgshyms(seq id no:1)的重链互补决定区(hcdr)1，
5、(b)包含氨基酸序列ninqigyssyyvesvkg(seq id no:2)、ninqigyssyygesvkg(seqid no:3)或ninqigyssyyeesvkg(seq id no:4)的hcdr2，和
6、(c)包含氨基酸序列gysaefahrsgldv(seq id no:5)、gysdefatrsgldv(seq idno:6)、gyseefahrsgldv(seq id no:7)、gysdefakrsgldv(seq id no:8)或gysdefahrsgldv(seq id no:9)的hcdr3，和
7、ii.可变轻链区(vl)，其包括
8、(a)包含氨基酸序列sgsssnigsnyvy(seq id no:10)的轻链互补决定区(lcdr)1，
9、(b)包含氨基酸序列rnnqrps(seq id no:11)的lcdr2，和
10、(c)包含氨基酸序列agwsrslhgav(seq id no:12)或agwsrelhgav(seq id no:13)的lcdr3。
11、在一个实施方式中，本公开提供分离的特异性针对cd3的人抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段与食蟹猴(cynomolgus)cd3交叉反应性结合。
12、在一个实施方式中，本公开提供分离的特异性针对cd3的人抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段是去免疫抗体。
13、在一个实施方式中，本公开提供分离的特异性针对cd3的人抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段在人类中引发免疫应答的风险降低。
14、在一个实施方式中，本公开提供分离的特异性针对cd3的人抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包含：vh，所述vh包含与选自seq id no:14、seq idno:15、seq id no:16、seq id no:17、seq id no:18和seq id no:19的氨基酸序列具有至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列，和/或vl，所述vl包含与氨基酸序列seq id no:20或seq id no:21具有至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。
15、在一个实施方式中，本公开提供分离的特异性针对cd3的人抗体或其抗原结合片段，其中vh和vl选自：
16、i.包含氨基酸序列seq id no:14的vh和包含氨基酸序列seq id no:20的vl，
17、ii.包含氨基酸序列seq id no:15的vh和包含氨基酸序列seq id no:21的vl，
18、iii.包含氨基酸序列seq id no:16的vh和包含氨基酸序列seq id no:21的vl，
19、iv.包含氨基酸序列seq id no:17的vh和包含氨基酸序列seq id no:21的vl，
20、v.包含氨基酸序列seq id no:18的vh和包含氨基酸序列seq id no:21的vl，以及
21、vi.包含氨基酸序列seq id no:19的vh和包含氨基酸序列seq id no:21的vl。
22、在本公开的一个实施方式中，所述分离的特异性针对cd3的人抗体或其抗原结合片段是重组抗体或其抗原结合片段。在本公开的一个实施方式中，所述分离的特异性针对cd3的人抗体或其抗原结合片段是单克隆抗体或其抗原结合片段。
23、在本公开的一个实施方式中，所述分离的特异性针对cd3的抗原结合片段是fab、fab’、(fab’)2、fv或scfv。在本公开的一个实施方式中，所述分离的特异性针对cd3的人抗体是全长抗体。
24、在一个实施方式中，本公开提供一种双特异性抗体，其包含根据本公开的分离的特异性针对cd3的人抗体的第一抗原结合片段和抗体的第二抗原结合片段，该抗体结合与所述第一抗原结合片段不同的靶抗原。在本公开的一个实施方式中，所述第二抗原结合片段与细胞表面抗原结合，特别是与肿瘤相关细胞表面抗原结合。
25、在本公开的一个实施方式中，根据本公开的所述分离的特异性针对cd3的人抗体或根据本公开的包含分离的特异性针对cd3的人抗体的抗原结合片段的双特异性抗体包含fc区，所述fc区包含降低与fc受体的结合和/或效应功能的一个或多个氨基酸取代。
26、在一个实施方式中，本公开提供一种核酸组合物，其包含编码分离的特异性针对cd3的人抗体或其抗原结合片段或根据本公开的包含分离的特异性针对cd3的人抗体的抗原结合片段的双特异性抗体的一个核酸序列或多个核酸序列。
27、在一个实施方式中，本公开提供一种载体组合物，其包含：包含根据本公开的一个核酸序列或多个核酸序列的一个载体或多个载体。在一个实施方式中，本公开提供一种宿主细胞，其包含根据本公开的载体组合物。在一个方面，所述宿主细胞是哺乳动物细胞。在一个方面，所述宿主细胞是原核细胞。
28、在一个方面，本公开提供一种产生根据本公开的抗体或其抗原结合片段的方法，其包括在适合于抗体表达的条件下培养所述宿主细胞并任选地回收所述抗体或其抗原结合片段的步骤。在另一方面，本公开提供一种通过本文所述方法产生的抗体或其抗原结合片段。
29、在一个实施方式中，本公开提供一种药物组合物，其包含：根据本公开的分离的特异性针对cd3的人抗体或其抗原结合片段、或根据本公开的包含分离的特异性针对cd3的人抗体的抗原结合片段的双特异性抗体、以及药学上可接受的载体或赋形剂。
30、在一个实施方式中，本公开提供分离的特异性针对cd3的人抗体或其抗原结合片段或根据本公开的药物组合物用作药物的用途。
31、所要求保护的抗体或其抗原结合片段具有实用性。此外，所要求保护的方法还具有生成此类抗体或其抗原结合片段的实用性。所要求保护的抗体或其抗原结合片段的用途是靶向表达cd3的t细胞，并刺激t细胞活化，例如在t细胞介导的杀伤是有益的或可取的情况下。特别是，所要求保护的抗体或其抗原结合片段用于治疗用途，例如治疗癌症。