本发明涉及肽，特别是细胞穿透肽，并且涉及这种细胞穿透肽与治疗性分子的缀合物。本发明还涉及此类肽或缀合物在治疗方法中或作为药物的用途，特别是在治疗基因病症并且尤其是神经肌肉疾病中的用途。
背景技术：
1、核酸药物是能够改变人类医疗保健的基因组药物。研究表明，此类疗法可能在包括神经肌肉疾病的广泛疾病领域中得到应用。例如，基于反义寡核苷酸的方法在神经肌肉疾病杜氏肌营养不良症(dmd)中调节前mrna剪接的应用已将此单基因病症置于精准医疗发展的前沿。
2、虽然用于治疗由剪接错误引起的疾病的反义治疗剂的领域已经取得了进展，但将此类治疗剂递送到需要它们的组织的问题阻碍了成功。2016年9月，美国食品药品监督管理局(fda)批准了对“eteplirsen”的加速审批，其是一种用于调节外显子51剪接的单链寡核苷酸，外显子51是导致dmd的区域。然而，肌营养不良蛋白的恢复水平令人失望，仅有约1％的正常肌营养不良蛋白水平。与等位基因病症贝克肌营养不良症的比较以及在mdx小鼠中进行的实验表明，需要至少约15％野生型的同质肌膜肌营养不良蛋白表达来保护肌肉免受运动引起的损伤。效果不佳的原因据推测是由于递送不佳。
3、因此，强烈且迫切地需要改善反义寡核苷酸的递送，以便为毁灭性基因疾病例如dmd提供更有效的疗法。
4、已经提出使用病毒作为递送媒介物，但是由于病毒外壳蛋白的免疫毒性和潜在的致癌作用，其使用受到限制。备选地，已经开发了多种非病毒递送载体，其中显示了肽由于其尺寸小、靶向特异性和大生物货物(cargo)的跨毛细血管递送的能力而最有前景。已经报道了多种肽的能力，这些肽可以单独地或携带生物货物渗透细胞。
5、多年来，细胞穿透肽(cpp)已与单链寡核苷酸(尤其是电中性的磷酰二胺吗啉代寡聚物(pmo)和肽核酸(pna))缀合，以通过有效地携带此类治疗剂跨细胞膜到达其在细胞核中的前mrna靶位点来增强此类治疗剂的细胞递送。已经表明，在dmd的mdx小鼠模型中全身施用后，与某些富含精氨酸的cpp缀合的pmo治疗剂(称为p-pmo或肽-pmo)可以增强骨骼肌中肌营养不良蛋白的产生。
6、具体地，开发了一组cpp，它们具有两个富含精氨酸的序列，其被中间短疏水序列隔开。这些肽的设计旨在提高血清稳定性，同时保持相对高水平的外显子跳跃，这最初是通过将其附着到pna治疗剂上来实现的。这些肽的其他衍生物被设计为pmo的缀合物，其被证明在小鼠全身施用后可导致全身骨骼肌肌营养不良蛋白的产生。尽管这些cpp在递送方面是有效的，但是它们的治疗应用却受到其相关毒性的限制。
7、还已经产生了仅具有单富含精氨酸的结构域的替代性细胞穿透肽，例如r6gly。这些cpp已被用于生产毒性降低的肽缀合物，但与双富含精氨酸的结构域的cpp相比，r6gly缀合物显示出较低功效。
8、因此，尚未证明当前可用的cpp适合用于人类诸如dmd的疾病的治疗。事实证明它们要么无效，要么毒性太大。
9、细胞穿透肽技术领域的挑战是使功效和毒性分离。迄今为止对cpp的研究表明，含有大量精氨酸残基的较长肽是细胞穿透能力的关键，大量证据教导增加精氨酸残基的数量。然而研究表明，这与毒性存在取舍，即简单地增加精氨酸残基的总数会增加毒性。迄今为止，本领域的研究工作尚未关注肽内精氨酸残基的定位，也没有关注cpp的整体结构。
10、本技术发明人现已鉴定、合成并测试了多种改进的cpp，其至少可以解决此问题。
技术实现思路
1、根据本发明的第一方面，提供了一种具有总长度为40个或更少的氨基酸残基的肽，所述肽包含至少第一和第二富含精氨酸的结构域，以及至少一个选自fqily(seq idno:35)、yqfli(seq id no:32)或ilfqy(seq id no:33)的疏水性结构域，其中所述肽包含至少一个氨基己酸(x)残基，每个富含精氨酸的结构域包含不超过3个精氨酸残基，并且其中所述第一富含精氨酸的结构域选自以下序列之一：rbrr(seq id no:1)、rbrxr(seq idno:2)、rr、rxr、xr和r。
2、根据第二方面，提供了一种缀合物，其包含与治疗性分子共价连接的根据第一方面的肽。
3、根据第三方面，提供了包含根据第二方面所述的缀合物的药物组合物。
4、根据第四方面，提供了根据第二方面的缀合物或根据第三方面的药物组合物，其用作药物。
5、根据第五方面，提供了根据第二方面的缀合物或根据第三方面的药物组合物，用于治疗神经肌肉系统或肌肉骨骼系统的疾病，优选神经肌肉系统或肌肉骨骼系统的基因疾病，优选神经肌肉系统或肌肉骨骼系统的遗传性基因疾病。
6、发明人成功地在本文描述的细胞穿透肽(cpp)中包括了最佳数量的精氨酸残基，同时保持了良好的穿透性和较低的毒性。本领域先前的观点是精氨酸残基的数量是决定cpp的功效/毒性取舍的最重要因素，并且这两个因素中必须有一个是做出妥协的，与之相反，本技术发明人发现，精氨酸残基在肽结构中的位置才是关键，而不是简单地增加精氨酸残基的数量。出乎意料地，本技术发明人发现，当富含精氨酸的结构域中的每一个不含有超过3个精氨酸残基且与特定疏水性结构域结合的情况下，肽结构既能实现具有良好的细胞穿透性的有利的功效，又能实现有利的毒性。这些肽，当在体外和体内与所运送的治疗性分子一起进行测试时，在骨骼肌中保持了良好的功效水平，同时通过测量生化标志物发现其具有低肾脏毒性。关键地，与以前的cpp相比，在类似的全身注射入小鼠后，本发明的肽被证明显示出惊人的降低的毒性。因此，本发明的肽与先前可获得的肽相比提供了改进的适用性以用作用于人类的疗法，并且可以用于治疗性缀合物以安全有效地治疗人类受试者。
7、本发明包括所描述的方面和特征的任何组合，除非明显不允许或明确避免这种组合。
8、本文使用的章节标题仅用于组织目的，而不应被解释为限制所描述的主题。
9、始终以“x”表示任何形式的人工的、合成制备的氨基酸氨基己酸，但是可以优选指代6-氨基己酸。
10、始终以“b”表示天然但非基因编码的氨基酸β-丙氨酸。
11、始终以“ac”表示相关肽的乙酰化。
12、始终以其他大写字母表示根据公认的字母氨基酸代码的相关基因编码的氨基酸残基。
13、富含精氨酸的结构域
14、本发明涉及具有特定结构的短细胞穿透肽，其中存在至少两个富含精氨酸的结构域。
15、适当地，所述肽包含至多4个富含精氨酸的结构域，至多3个富含精氨酸的结构域。
16、适当地，所述肽包含2个富含精氨酸的结构域。
17、适当地，当存在时，所述肽包括第一、第二、第三和第四富含精氨酸的结构域。适当地，所述肽包含第一富含精氨酸的结构域和第二富含精氨酸的结构域。
18、适当地，任何所述的富含精氨酸的结构域可具有1至12个氨基酸残基的长度，适当地，1至10个氨基酸残基的长度，适当地，1至8个氨基酸残基的长度，适当地，1至6个氨基酸残基的长度，适当地，2至6个氨基酸残基的长度。适当地，任何所述富含精氨酸的结构域可具有12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个氨基酸残基的长度。
19、适当地，所述结构域之一可以由4个或更少的氨基酸残基组成。适当地，第一富含精氨酸的结构域可以由4个或更少的氨基酸残基组成。因此，适当地，第一富含精氨酸的结构域可以由1至4个氨基酸残基组成。
20、适当地，所述肽中存在的任何其他富含精氨酸的结构域比所述第一富含精氨酸的结构域更长。适当地，所述第二富含精氨酸的结构域比所述第一富含精氨酸的结构域更长。因此，适当地，所述第二富含精氨酸的结构域可以包含4个以上的氨基酸残基。
21、适当地，所述肽中存在的任何其他富含精氨酸的结构域可以具有3至12个氨基酸残基的长度，适当地，3至8个氨基酸残基的长度。适当地，所述肽中存在的任何其他富含精氨酸的结构域具有5、6、7或8个氨基酸残基的长度。
22、适当地，所述第二富含精氨酸的结构域具有5、6、7或8个氨基酸残基的长度。
23、替代地，所述第一富含精氨酸的结构域和所述肽中存在的任何其他富含精氨酸的结构域可以具有相似的长度或相同的长度。例如，所述第一和第二富含精氨酸的结构域均可以具有4、3或2个氨基酸残基的长度。
24、适当地，富含精氨酸的臂结构域包含多个精氨酸残基。“富含精氨酸”是指至少30％的结构域由所述残基形成。
25、适当地，每个富含精氨酸的结构域包含大部分的精氨酸残基。
26、适当地，每个富含精氨酸的结构域包含至少30％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少60％、至少65％、至少70％的精氨酸残基。在某些情况下，富含精氨酸的结构域可以包含100％的精氨酸残基。
27、适当地，每个富含精氨酸的结构域包含不超过3个精氨酸残基。适当地，每个富含精氨酸的结构域可以包含1-3个精氨酸残基，适当地，2或3个精氨酸残基。
28、适当地，所述第一富含精氨酸的结构域包含至少30％、至多100％，及其之间的任何值的精氨酸残基。适当地，所述第一富含精氨酸的结构域包含约30％、50％、75％或100％的精氨酸残基。
29、适当地，所述第二富含精氨酸的结构域包含至少50％、至多80％，及其之间的任何值的精氨酸残基。适当地，所述第二富含精氨酸的结构域包含约50％、55％、60％或70％的精氨酸残基。
30、适当地，每个富含精氨酸的结构域除了精氨酸之外还可以包含其他氨基酸残基。适当地，所述其他氨基酸残基是阳离子的或中性的。阳离子氨基酸可以选自：精氨酸、组氨酸、赖氨酸。适当地，阳离子氨基酸在生理ph下具有正电荷。中性氨基酸可选自：氨基己酸、丙氨酸、β-丙氨酸、脯氨酸、甘氨酸、半胱氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、蛋氨酸、色氨酸、苯丙氨酸。适当地，中性氨基酸不具有电荷。
31、适当地，每个富含精氨酸的结构域由精氨酸、β-丙氨酸和/或氨基己酸残基组成。
32、适当地，所述富含精氨酸的结构域包含总共至少一个β-丙氨酸残基，适当地，一个以上的β-丙氨酸残基。“总共”是指所有富含精氨酸的结构域中存在的β-丙氨酸残基的数量的总和。适当地，每个富含精氨酸的结构域包含一个或多个β-丙氨酸残基。适当地，所述第一和第二富含精氨酸的结构域包含总共一个或多个β-丙氨酸残基。适当地，每个富含精氨酸的结构域可包含总共1-5个β-丙氨酸残基，适当地，总共1或2个β-丙氨酸残基。
33、适当地，所述肽包含至少一个氨基己酸残基(x)。适当地，富含精氨酸的结构域包含总共至少一个氨基己酸残基(x)，在一些情况下，肽中或富含精氨酸的结构域中可以存在一个以上的氨基己酸残基。“总共”是指所有富含精氨酸的结构域中存在的氨基己酸残基的数量的总和。适当地，每个富含精氨酸的结构域可以包含一个或多个氨基己酸残基。适当地，所述第一和第二富含精氨酸的结构域包含总共一个或多个氨基己酸残基。适当地，每个富含精氨酸的结构域可包含总共1-5个氨基己酸残基，适当地，总共1或2个氨基己酸残基。在一个实施方案中，所述第一或第二富含精氨酸的结构域之一包含一个或多个氨基己酸残基，适当地，一个氨基己酸残基。
34、适当地，本文的“至少一个”表示所提及的特征中的一个或一个以上。
35、适当地，所述肽包含至少两个富含精氨酸的结构域，适当地，这些富含精氨酸的结构域形成所述肽的臂。适当地，所述富含精氨酸的结构域位于所述肽的n和c末端。因此，适当地，所述富含精氨酸的结构域可以称为所述肽的臂结构域。任何在本文中提及的“富含精氨酸的结构域”均可用“臂结构域”代替。
36、在一个实施方案中，所述肽包含两个富含精氨酸的结构域，其中一个位于所述肽的n-末端，且一个位于所述肽的c-末端。适当地，在所述肽的任一端。适当地，所述第一富含精氨酸的结构域位于所述肽的n-末端。适当地，所述第一富含精氨酸的结构域是所述肽的n-末端。适当地，所述第二富含精氨酸的结构域位于所述肽的c-末端。适当地，所述第二富含精氨酸的结构域是所述肽的c-末端。
37、适当地，除了其他基团(例如末端修饰、接头和/或治疗性分子)之外，在所述肽的n-末端和c-末端不存在其他氨基酸或结构域。为避免疑义，除本文所述和要求保护的“肽”外，还可存在这样的其他基团。因此，适当地，每个富含精氨酸的结构域形成所述肽的末端。适当地，这并不妨碍如本文所述的其他的接头基团的存在。
38、适当地，所述富含精氨酸的结构域包含选自以下的氨基酸单元：r、b、x、rr、bb、xx、rb、rx、xr、br、bx、xb、rbr、rbb、brr、bbr、brb、rbx、brx、rxb、xrb、bxr、rxr、bxb、rxx、bxx、xxr、xxb、rrx、xrr、bbx、xbb、xrx、xbx、rrr、bbb、xxx或其任意组合。
39、适当地，每个富含精氨酸的结构域包含以下序列的任一个：rbrr(seq id no:1)、rr、xr、r、rbrxr(seq id no:2)和rxr。适当地，每个富含精氨酸的结构域包含以下序列的任一个：rbrr(seq id no:1)、rbrxr(seq idno:2)、rr和rxr。替代地，每个富含精氨酸的结构域包含以下序列的任一个：rxrbr(seq id no:3)、rxrxr(seq id no:4)、rrxbr(seq id no:5)、rrbrx(seq id no:6)、rrbxr(seq id no:7)、xrbrr(seq id no:8)、rbrb(seq id no:9)、rrbb(seq id no:10)、bbrr(seq id no:11)、brbr(seq id no:12)、rrrb(seq id no:13)、bbbr(seq id no:14)、rxrb(seq id no:15)、rxbr(seq id no:16)、rbrx(seq id no:17)、brbx(seq id no:18)、xrbr(seq id no:19)、xbrb(seq id no:20)、rbxr(seq id no:21)、rrxb(seq id no:22)、rrbx(seq id no:23)、xrbb(seq id no:24)、xbrr(seq id n0:25)、rxbb(seq id no:26)、xrrr(seq id no:27)、rrrx(seq id no:28)、brxr(seq id no:29)、bbxr(seq id no:30)、bbrx(seq id no:31)、rbr、rbb、brr、bbr、brb、rbx、brx、rxb、xrb、bxr、rxr，bxb、rxx、xxr、rrx、xrr、xrx、rrr、rx、rb、br。
40、适当地，每个富含精氨酸的结构域由以下序列的任一个组成：rbrr(seq id no:1)、rr、xr、r、rbrxr(seq id no:2)和rxr。适当地，每个富含精氨酸的结构域由以下序列的任一个组成：rbrr(seq id no:1)、rbrxr(seq id no:2)、rr和rxr。替代地，每个富含精氨酸的结构域由以下序列的任一个组成：rxrbr(seq id no:3)、rxrxr(seq id no:4)、rrxbr(seq id no:5)、rrbrx(seq id no:6)、rrbxr(seq id no:7)、xrbrr(seq id no:8)、rbrb(seq id no:9)、rrbb(seq id no:10)、bbrr(seq id no:11)、brbr(seq id no:12)、rrrb(seq id no:13)、bbbr(seq id no:14)、rxrb(seq id no:15)、rxbr(seq id no:16)、rbrx(seq id no:17)、brbx(seq id no:18)、xrbr(seq id no:19)、xbrb(seq id no:20)、rbxr(seq id no:21)、rrxb(seq id no:22)、rrbx(seq id no:23)、xrbb(seq id no:24)、xbrr(seq id n0:25)、rxbb(seq id no:26)、xrrr(seq id no:27)、rrrx(seq id no:28)、brxr(seq id no:29)、bbxr(seq id no:30)、bbrx(seq id no:31)、rbr、rbb、brr、bbr、brb、rbx、brx、rxb、xrb、bxr、rxr，bxb、rxx、xxr、rrx、xrr、xrx、rrr、rx、rb、br。
41、适当地，所述第一富含精氨酸的结构域包含选自以下的序列：rbrr(seq id no:1)、rr、xr、r、rbrxr(seq id no:2)和rxr。适当地，所述第一富含精氨酸的结构域包含选自以下的序列：rbrr(seq id no:1)、rbrxr(seq id no:2)、rr和rxr。适当地，所述第一富含精氨酸的结构域包含选自以下的序列或由选自以下的序列组成：rbrr(seq id no:1)和rr。
42、适当地，所述第二富含精氨酸的结构域包含选自以下的序列：rbrr(seq id no:1)、rr、xr、r、rbrxr(seq id no:2)、rxr、brxr(seq id no:29)和rbxr(seq id no:21)。适当地，所述第二富含精氨酸的结构域包含选自以下的序列：rbrr(seq id no:1)、rbrxr(seqid no:2)、rr和rxr。适当地，所述第二富含精氨酸的结构域包含选自以下的序列或由选自以下的序列组成：rbrxr(seq id no:2)和rxr。
43、在一个实施方案中，所述第一富含精氨酸的结构域是rbrr(seq id no:1)或rr。在一个实施方案中，所述第一富含精氨酸的结构域是rbrr(seq id no:1)。在一个实施方案中，所述第二富含精氨酸的结构域是rbrxr(seq id no:2)或rxr。在一个实施方案中，所述第二富含精氨酸的结构域是rbrxr(seq id no:2)。
44、适当地，所述肽中的每个富含精氨酸的结构域可以相同或不同。适当地，所述肽中的每个富含精氨酸的结构域不同。
45、疏水性结构域
46、本发明涉及具有特定结构的短的细胞穿透肽，其中存在至少一个疏水性结构域。
47、本文所提及的“疏水性”表示具有排斥水的能力的或不与水混合的氨基酸或氨基酸的结构域。
48、适当地，所述肽包含至多3个疏水性结构域，至多2个疏水性结构域。
49、适当地，所述肽包含1个疏水性结构域。
50、适当地，所述肽包含一个或多个疏水性结构域，每个疏水性结构域具有至少3个氨基酸残基的长度。
51、适当地，每个疏水性结构域具有3-6个氨基酸的长度。适当地，每个疏水性结构域具有5个氨基酸的长度。
52、适当地，每个疏水性结构域可包含非极性、极性和疏水性氨基酸残基。
53、疏水性氨基酸残基可以选自：丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、蛋氨酸和色氨酸。
54、非极性氨基酸残基可以选自：脯氨酸、甘氨酸、半胱氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸。
55、极性氨基酸残基可以选自：丝氨酸、天冬酰胺、羟脯氨酸、组氨酸、精氨酸、苏氨酸、酪氨酸、谷氨酰胺。
56、适当地，所述疏水性结构域不包含亲水性氨基酸残基。
57、适当地，每个疏水性结构域包含大部分疏水性氨基酸残基。适当地，每个疏水性结构域包含至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、100％的疏水性氨基酸。适当地，每个疏水性结构域由疏水性氨基酸残基组成。
58、适当地，每个疏水性结构域的疏水性为至少0.3、至少0.4、至少0.5、至少0.6、至少0.7、至少0.8、至少0.8、至少1.0、至少1.1、至少1.2、至少1.3。
59、适当地，每个疏水性结构域的疏水性为至少0.3，至少0.35，至少0.4，至少0.45。
60、适当地，每个疏水性结构域的疏水性为至少1.2，至少1.25，至少1.3，至少1.35。
61、适当地，每个疏水性结构域的疏水性为0.4至1.4。
62、适当地，疏水性由white和wimley测量：w.c.wimley和s.h.white,"experimentally determined hydrophobicity scale for proteins at membraneinterfaces"nature struct biol 3:842(1996)。
63、适当地，每个疏水性结构域包含至少3个、至少4个疏水性氨基酸残基。
64、适当地，每个疏水性结构域包含苯丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、酪氨酸、色氨酸、脯氨酸、精氨酸和谷氨酰胺残基。适当地，每个疏水性结构域由苯丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、酪氨酸、色氨酸、脯氨酸、精氨酸和/或谷氨酰胺残基组成。
65、在一个实施方案中，每个疏水性结构域由苯丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、精氨酸、酪氨酸和/或谷氨酰胺残基组成。
66、适当地，所述肽包含一个疏水性结构域。适当地，所述或每个疏水性结构域基本上位于所述肽的中心。适当地，因此，所述疏水性结构域可以被称为“核心结构域”。适当地，所述或每个疏水性结构域在任一侧侧接富含精氨酸的结构域，其如上所述可称为“臂结构域”。适当地，每个臂结构域包含富含精氨酸的结构域。
67、在一个实施方案中，所述肽包含侧接疏水性结构域的两个富含精氨酸的结构域。在一个实施方案中，所述肽由侧接疏水性结构域的两个富含精氨酸的结构域组成。换言之：所述肽可以包含侧接核心结构域的两个臂结构域，或者所述肽可以由侧接核心结构域的两个臂结构域组成。
68、适当地，所述或每个疏水性结构域可以包含以下序列之一：yqfli(seq id no:32)、fqily(seq id no:35)、yrfli(seq id no:34)、ilfqy(seq id no:33)、fqiy(seq idno:36)、www、wwpww(seq id no:37)、wpww(seq id no:38)、wwpw(seq id no:39)或其任意组合。
69、适当地，所述或每个疏水性结构域由以下序列之一组成：yqfli(seq id no:32)、fqily(seq id no:35)、yrfli(seq id no:34)、ilfqy(seq id no:33)、fqiy(seq id no:36)、www、wwpww(seq id no:37)、wpww(seq id no:38)、wwpw(seq id no:39)或其任意组合。
70、适当地，所述或每个疏水性结构域选自：fqily(seq id no:35)、yqfli(seq idno:32)、和ilfqy(seq id no:33)。
71、在一个实施方案中，所述或每个疏水性结构域由yqfli(seq id no:32)组成。
72、在一个实施方案中，所述或每个疏水性结构域由ilfqy(seq id no:33)组成。
73、适当地，所述肽中的每个疏水性结构域可以具有相同的序列或不同的序列。
74、肽
75、本发明涉及短的细胞穿透肽，其用于在医学病况的治疗中运输治疗性货物分子。
76、所述肽的序列是连续的单个分子，因此所述肽的结构域是连续的。适当地，所述肽在n-末端和c-末端之间包含呈线性排列的几个结构域。适当地，所述结构域选自上述富含精氨酸的结构域和疏水性结构域。适当地，所述肽由富含精氨酸的结构域和疏水性结构域组成，其中所述结构域如上所定义。
77、每个结构域都具有上面相关部分所述的共有序列特征，但是每个结构域的确切序列可以进行变异和修饰。因此，每个结构域可能有一系列序列。每个可能的结构域序列的组合产生一系列肽结构，每个肽结构形成本发明的一部分。所述肽结构的特征描述如下。
78、适当地，疏水性结构域分隔任意两个富含精氨酸的结构域。适当地，每个疏水性结构域在其任一侧都侧接有富含精氨酸的结构域。
79、适当地，没有富含精氨酸的结构域与另一富含精氨酸的结构域相邻。
80、在一个实施方案中，所述肽包含侧接有两个富含精氨酸的结构域的一个疏水性结构域，其呈如下排列：
81、[富含精氨酸的结构域]-[疏水性结构域]-[富含精氨酸的结构域]。
82、因此，适当地，所述疏水性结构域可以被称为核心结构域，并且每个富含精氨酸的结构域可以被称为臂结构域。适当地，所述富含精氨酸的臂结构域侧接在所述疏水性核心结构域的任一侧。
83、在一个实施方案中，所述肽由两个富含精氨酸的结构域和一个疏水性结构域组成。
84、在一个实施方案中，所述肽由侧接有两个富含精氨酸的臂结构域的一个疏水性核心结构域组成。
85、因此，在一个实施方案中，所述肽包含以下结构或由以下结构组成：
86、[第一富含精氨酸的结构域]-[疏水性结构域]-[第二富含精氨酸的结构域]。
87、在一个实施方案中，所述肽包含一个疏水性结构域和两个富含精氨酸的结构域，或由一个疏水性结构域和两个富含精氨酸的结构域组成，所述疏水性结构域包含选自以下的序列：fqily(seq id no:35)、yqfli(seq id no:32)或ilfqy(seq id no:33)；所述富含精氨酸的结构域各自包含选自以下的序列：rbrr(seq id no:1)、rbrxr(seq id no:2)、rr、rxr、xr、r、brxr(seq id no:29)和rbxr(seq id no:21)。
88、在一个实施方案中，所述肽由一个疏水性结构域和两个富含精氨酸的结构域组成，所述疏水性结构域包含选自以下的序列：fqily(seq id no:35)、yqfli(seq id no:32)或ilfqy(seq id no:33)；所述富含精氨酸的结构域各自包含选自以下的序列：rbrr(seqid no:1)、rbrxr(seq id no:2)、rr、rxr、xr、r、brxr(seq id no:29)和rbxr(seq id no:21)。
89、在一个实施方案中，所述肽包含一个疏水性结构域、第一富含精氨酸的结构域和第二富含精氨酸的结构域，或由一个疏水性结构域、第一富含精氨酸的结构域和第二富含精氨酸的结构域组成，所述疏水性结构域包含选自以下的序列：fqily(seq id no:35)、yqfli(seq id no:32)或ilfqy(seq id no:33)；所述第一富含精氨酸的结构域包含选自rbrr(seq id no:1)和rr的序列；所述第二富含精氨酸的结构域包含选自rbrxr(seq idno:2)、xr和rxr的序列。
90、在一个实施方案中，所述肽由一个疏水性结构域、第一富含精氨酸的结构域和第二富含精氨酸的结构域组成，所述疏水性结构域包含选自以下的序列：fqily(seq id no:35)、yqfli(seq id no:32)或ilfqy(seq id no:33)；所述第一富含精氨酸的结构域由选自以下的序列组成：rbrr(seq id no:1)和rr；所述第二富含精氨酸的结构域由选自以下的序列组成：rbrxr(seq id no:2)、xr和rxr。
91、在任何这样的实施方案中，可以存在其他基团，例如接头、末端修饰和/或治疗性分子。
92、适当地，所述肽是n-末端修饰的。
93、适当地，所述肽是n-乙酰化的、n-甲基化的、n-三氟乙酰化的、n-三氟甲基磺酰化的或n-甲基磺酰化的。适当地，所述肽是n-乙酰化的。
94、任选地，所述肽的n端可以是未修饰的。
95、在一个实施方案中，所述肽是n-乙酰化的。
96、适当地，所述肽是c-末端修饰的。有利地，所述c-末端修饰提供了用于将所述肽连接至治疗性分子的手段。
97、因此，所述c-末端修饰可包含接头，反之亦然。适当地，所述c-末端修饰可由接头组成，反之亦然。适当的接头在本文的其他地方描述。
98、适当地，所述肽包含包含c-末端羧基。
99、适当地，所述c-末端羧基由如甘氨酸或β-丙氨酸残基接头提供。在一个实施方案中，所述c末端羧基由β-丙氨酸残基提供。适当地，所述c末端β-丙氨酸残基也是接头。
100、替代地或额外地，所述c-末端修饰可包含间隔物。适当地，所述间隔物(如果存在)位于肽和接头之间。适当的间隔物在本文的其他地方描述。
101、适当地，因此，每个富含精氨酸的结构域还可以包含n或c末端修饰。适当地，所述富含精氨酸的结构域在c末端包含c-末端修饰。适当地，所述富含精氨酸的结构域在n末端包含n-末端修饰。适当地，所述富含精氨酸的结构域在c末端包含接头基团并任选地包含间隔物。适当地，所述富含精氨酸的结构域在c末端包含c-末端β-丙氨酸。适当地，所述富含精氨酸的结构域在n末端是n-乙酰化的。
102、本发明的肽被限定为具有40个或更少的氨基酸残基的总长。因此，所述肽可以被认为是寡肽。
103、适当地，所述肽的长度小于35aa，优选小于30aa，优选小于25aa，优选小于20aa。
104、适当地，所述肽的总长为3-30个氨基酸残基，适当地，为5-30个氨基酸残基、10-30个氨基酸残基、10-20个氨基酸残基、10-15个氨基酸残基。
105、适当地，所述肽的总长为至少10个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个氨基酸残基。
106、本发明的肽可以包含总共10个或更少的精氨酸残基。“总共”是指整个所述肽中存在的精氨酸残基数量的总和。适当地，所述肽可包含9个或更少、8个或更少、7个或更少的精氨酸残基，适当地，6个或更少的精氨酸残基。
107、本发明的肽可以包含总共至少3个精氨酸残基。适当地，所述肽可包含3个或更多个精氨酸残基，适当地，4个或更多个精氨酸残基，适当地，5个或更多个精氨酸残基，适当地，6个或更多个精氨酸残基。
108、适当地，所述肽可包含总共至少3个且至多10个(即10个或更少)精氨酸残基，适当地，至少3个且至多7个精氨酸残基，适当地，至少5个且至多7个精氨酸残基，适当地，至少6个且至多7个精氨酸残基。适当地，所述肽含有总共5个精氨酸残基。适当地，所述肽含有总共6个精氨酸残基。适当地，所述肽含有总共7个精氨酸残基。
109、适当地，所述肽能够穿透细胞。因此，所述肽可以被认为是细胞穿透肽。
110、适当地，所述肽用于附接至治疗性分子。适当地，所述肽用于将治疗性分子转运到靶细胞中。适当地，所述肽用于将治疗性分子递送到靶细胞中。因此，所述肽可以被认为是载体肽。
111、适当地，所述肽能够穿透进入到细胞和组织中，适当地，进入到细胞的核中。适当地，进入肌肉组织中。
112、适当地，所述肽可以选自以下序列的任一个：
113、rbrryqflirbrxr(pip8b2del01)(seq id no:40)
114、rryqflirbrxr(pip8b2del02)(seq id no:41)
115、rbrryqflirxr(pip8b2del05)(seq id no:42)
116、rryqflixr(pip8b2del06)(seq id no:43)
117、rbrrilfqyrbrxr(pip5b2del01)(seq id no:44)
118、rbrrfqilyrbrxr(pip9b2del01)(seq id no:53)
119、rbrryqflibrxr(pip8b2del08)(seq id no:70)
120、rbrryqflirbxr(pip8b2del09)seq id no:71)。
121、适当地，所述肽选自以下序列的任一个：rbrrfqilyrbrxr(pip9b2del01)(seq idno:53)、rbrryqflirbrxr(pip8b2del01)(seq id no:40)和rbrrilfqyrbrxr(pip5b2del01)(seq id no:44)。
122、在一个实施方案中，所述肽由以下序列组成：rbrryqflirbrxr(pip8b2del01)(seqid no:40)。
123、在一个实施方案中，所述肽由以下序列组成：rbrrilfqyrbrxr(pip5b2del01)(seqid no:44)。
124、在一些替代方面中，本发明可以涉及选自以下序列之一的肽：
125、rxrrbrryqflirxr(pip8b2del03)(seq id no:50)
126、rxrrbrryqflir(pip8b2del04)(seq id no:51)
127、rbrryrflirbrxr(pip7b2del01)(seq id no:52)
128、rbryqflirrbrxr(pip8b2del07)(seq id no:54)。
129、任选地与本文其他地方定义的接头组合。适当地，本文中的任何陈述、方面或实施方案可同样适用于上述替代方面的肽。
130、因此，适当地，在一些替代方面，所述疏水性结构域可以包括yrfli(seq id no:34)。
131、缀合物
132、本发明的肽可以与治疗性分子共价连接以提供缀合物。
133、所述治疗性分子可以是用于治疗疾病的任何分子。所述治疗性分子可以选自：核酸、肽核酸、反义寡核苷酸(例如pna、pmo)、mrna、grna(例如，在使用crispr/cas9技术时)、短干扰rna、微小rna、antagomirna、肽、环肽、蛋白质、药品、药物或纳米颗粒。
134、在一个实施方案中，所述治疗性分子是反义寡核苷酸。
135、适当地，所述反义寡核苷酸包含磷酰二胺吗啉代寡核苷酸(pmo)。
136、替代地，所述寡核苷酸可以是修饰的pmo或任何其他电荷中性的寡核苷酸，例如肽核酸(pna)、化学修饰的pna如γ-pna(bahal,nat.comm.2016)、寡核苷酸氨基磷酸酯(其中磷酸根的非桥接氧被胺或烷基胺取代)如wo2016028187a1中所述的那些，或任何其他部分或完全电荷中和的寡核苷酸。
137、所述治疗性反义寡核苷酸序列可以选自本领域任何可用的序列，例如，用于dmd中外显子跳跃的反义寡核苷酸，其描述于https://research-repository.uwa.edu.au/en/publications/antisense-oligonucleotide-indu ced-exon-skipping-across-the-human中，或用于治疗sma的与issn1或in7序列互补的治疗性反义寡核苷酸，其描述于zhou,hgt,2013；以及hammond等人,2016；以及osman等人,hmg,2014中。
138、在一个实施方案中，所述缀合物的治疗性分子是与基因靶标的前mrna互补的寡核苷酸。
139、适当地，与基因靶标的前mrna互补的寡核苷酸引起改变前mrna的空间阻断事件，从而导致了改变的mrna，并因此导致了改变了序列的蛋白质。适当地，所述空间阻断事件可以是外显子包含或外显子跳跃。在一个实施方案中，所述空间阻断事件是外显子跳跃。
140、任选地，可在附接至肽之前将赖氨酸残基添加至治疗性分子(例如pmo或pna)的一端或两端以改善水溶性。
141、适当地，所述治疗性分子的分子量小于15000da，适当地小于13000da或适当地小于10000da。
142、适当地，所述肽在c末端共价连接至所述治疗性分子。
143、适当地，如果需要，所述肽通过接头共价连接至所述治疗性分子。
144、所述接头可以选自任何合适的序列。
145、适当地，所述接头存在于所述肽和所述治疗性分子之间。适当地，所述接头是所述肽和所述治疗性分子的间隔基团。
146、在一个实施方案中，所述缀合物包含通过接头共价连接至治疗性分子的肽。在一个实施方案中，所述缀合物包含以下结构：
147、[肽]-[接头]-[治疗性分子]
148、在一个实施方案中，所述缀合物由以下结构组成：
149、[肽]-[接头]-[治疗性分子]
150、适当的接头包括，例如，c-末端半胱氨酸残基，其允许形成二硫化物、硫醚或硫醇-马来酰亚胺连接；c-末端醛，以形成肟，与肽上的碱性氨基酸或肽上的羧酸部分发生点击反应或形成吗啉代连接，所述肽共价缀合至氨基以形成羧酰胺连接。
151、适当地，所述接头的长度为1-5个氨基酸。适当地，所述接头可以包括本领域已知的任何接头。
152、适当地，所述接头选自以下序列的任一个：g、bc、xc、c、ggc、bbc、bxc、xbc、x、xx、b、bb、bx和xb。适当地，所述接头可以选自琥珀酸、谷氨酸、谷氨酸或γ-氨基丁酸(gaba)。
153、在一个实施方案中，所述接头是β-丙氨酸。
154、因此，适当地，与接头组合的肽可以选自以下序列的任一个：
155、rbrryqflirbrxr-b(seq id no:45)
156、rryqflirbrxr-b(seq id no:46)
157、rbrryqflirxr-b(seq id no:47)
158、rryqflixr-b(seq id no:48)
159、rbrrilfqyrbrxr-b(seq id no:49)
160、rbrrfqilyrbrxr-b(seq id no:62)
161、rbrryqflibrxr-b(pip8b2del08)(seq id no:72)
162、rbrryqflirbxr-b(pip8b2del09)(seq id no:73)。
163、适当地，与接头组合的肽选自以下序列之一：rbrrfqilyrbrxr-b(seq id no:62)、rbrryqflirbrxr-b(seq id no:45)、rbrrilfqyrbrxr-b(seq id no:49)。
164、在一个实施方案中，与接头组合的肽由以下序列组成：rbrryqflirbrxr-b(seq idno:45)。
165、在一个实施方案中，与接头组合的肽由以下序列组成：rbrrilfqyrbrxr-b(seq idno:49)。
166、在另一实施方案中，所述肽通过羧酰胺连接与治疗性分子缀合。
167、所述缀合物的接头可以形成所述肽所连接的治疗性分子的一部分。替代地，所述治疗性分子的附着可以直接连接至肽的c-末端。适当地，在这样的实施方案中，不需要接头。
168、替代地，可以将所述肽化学缀合至治疗性分子。化学连接可以通过例如二硫化物、烯基、炔基、芳基、醚、硫醚、三唑、酰胺、羧酰胺、尿素、硫脲、氨基脲、卡巴肼、肼、肟、磷酸酯、氨基磷酸酯、硫代磷酸酯、硼烷磷酸酯、亚氨基磷酸酯或硫醇-马来酰亚胺连接。
169、任选地，可以在治疗性分子的n-末端添加半胱氨酸以允许与肽形成二硫键，或者可以对n-末端进行溴乙酰化以将硫醚缀合至肽。
170、本发明的肽可以等效地与成像分子共价连接以提供缀合物。
171、适当地，所述成像分子可以是能够使缀合物可视化的任何分子。适当地，所述成像分子可以指示缀合物的位置。适当地，所述缀合物在体外或体内的位置。适当地，提供了一种监测包含成像分子的缀合物的位置的方法，所述方法包括：将所述缀合物施用于受试者并且对所述受试者进行成像以定位所述缀合物。
172、所述成像分子的实例包括检测分子、对比分子或增强分子。适当的成像分子可以选自放射性核素；荧光团；纳米粒子(例如纳米壳)；纳米笼；发色剂(例如酶)、放射性同位素、染料、不透射线的材料、荧光化合物及其组合。
173、适当地，使用成像技术使所述成像分子可视化，所述成像技术可以是细胞成像技术或医学成像技术。适当的细胞成像技术包括例如成像流式细胞术、荧光显微镜、相差显微镜、sem、tem。适当的医学成像技术包括例如x射线、荧光检查、mri、闪烁扫描术、spect、pet、ct、cat、fnri。
174、在某些情况下，所述成像分子可被视为诊断分子。适当地，诊断分子能够使用所述缀合物诊断疾病。适当地，可以通过使用成像分子确定所述缀合物的位置来实现疾病的诊断。适当地，提供了一种诊断疾病的方法，所述方法包括将有效量的包含成像分子的缀合物施用于受试者并监测所述缀合物的位置。
175、适当地，诸如包含成像分子的缀合物的连接之类的更多细节与以上所描述的关于包含治疗性分子的缀合物的那些相同。
176、适当地，本发明的肽可以与治疗性分子和成像分子共价连接以提供缀合物。因此，适当地，提供了缀合物，其包含与治疗性分子和成像分子共价连接的根据本发明的肽。
177、适当地，所述缀合物能够穿透进入到细胞和组织中，适当地进入到细胞的核中。适当地，进入肌肉组织中。
178、适当地，本文列出的任何肽均可用于根据本发明的缀合物。
179、适当地，在任何情况下，所述肽可进一步包含如上所述的n-末端修饰。
180、药物组合物
181、本发明的缀合物可以配制成药物组合物。
182、适当地，所述药物组合物包含本发明的缀合物。
183、适当地，所述药物组合物可以进一步包含药学上可接受的稀释剂、佐剂或载体。
184、适当的药学上可接受的稀释剂、佐剂和载体是本领域众所周知的。
185、如本文所用，短语“药学上可接受的”是指那些配体、材料、制剂和/或剂型，其在合理的医疗判断范围内，适用于与人类和动物的组织接触，而没有过度的毒性、刺激、过敏反应或其他问题或并发症，符合合理的收益/风险比。
186、如本文所用，短语“药学上可接受的载体”是指药学上可接受的材料、制剂或媒介物，如液体或固体填充剂、稀释剂、赋形剂、溶剂或封装材料，其涉及将所述缀合物从身体的一个器官或部位携带或运输到身体的另一个器官或部位。在与所述组合物的其他组分相容的意义上来说，每个细胞穿透肽必须是“可接受的”，例如肽和治疗性分子，并且对个体无害。可以重构和施用的冻干组合物也在本发明组合物的范围内。
187、药学上可接受的载体可以是例如赋形剂、媒介物、稀释剂及其组合。例如，当将所述组合物口服施用时，它们可以被配制成片剂、胶囊剂、颗粒剂、粉末剂或糖浆剂；或者用于肠胃外施用时，它们可以被配制成注射剂、滴注制剂或栓剂。这些组合物可以通过常规方法制备，并且如果需要，可以将活性化合物(即缀合物)与任何常规添加剂混合，例如赋形剂、粘合剂、崩解剂、润滑剂、矫味剂、增溶剂、助悬剂、乳化剂、包衣剂或其组合。
188、应当理解，本公开的药物组合物可以进一步包括其他已知的治疗剂、药物，将化合物修饰成前药等，用于在医学用途下减轻、调节、预防和治疗本文所述的疾病、病症和病况。
189、适当地，所述药物组合物用作药物。适当地，以与本文所述缀合物相同的方式用作药物。本文所述的与使用缀合物的医学治疗有关的所有特征均适用于所述药物组合物。
190、因此，在本发明的另一方面，提供了根据第四方面的药物组合物用于用作药物。在另一方面，提供了一种治疗受试者的疾病或病况的方法，其包括向所述受试者施用有效量的根据第四方面的药物组合物。
191、医学用途
192、包含本发明的肽的缀合物可以被用作用于治疗疾病的药物。
193、所述药物可以是如上限定的药物组合物的形式。
194、还提供了治疗需要治疗疾病状况的患者或受试者的方法，所述方法包括向患者或受试者施用治疗有效量的所述缀合物的步骤。
195、适当地，医学治疗需要将所述治疗性分子递送到细胞中，适当地递送到细胞的核中。
196、待治疗的疾病可以包括任何疾病，其中由治疗性分子对细胞和/或核膜的穿透性改善可以导致改善的治疗效果。
197、适当地，所述缀合物用于治疗神经肌肉系统的疾病。
198、包含本发明的肽的缀合物适用于治疗神经肌肉系统的基因疾病。包含本发明的肽的缀合物适用于治疗基因神经肌肉疾病。在适当的实施方案中，提供了根据第二方面的缀合物，用于治疗神经肌肉系统的基因疾病。适当地，所述缀合物用于治疗遗传性基因疾病。适当地，所述缀合物用于治疗神经肌肉系统的遗传性基因疾病。适当地，所述缀合物用于治疗遗传性基因神经肌肉疾病。适当地，所述缀合物用于治疗神经肌肉系统的遗传性x连锁基因疾病。适当地，所述缀合物用于治疗遗传性x连锁神经肌肉疾病。
199、适当地，所述缀合物用于治疗由剪接缺陷引起的疾病。在这样的实施方案中，所述治疗性分子可以包含能够预防或纠正剪接缺陷和/或增加正确剪接的mrna分子的产生的寡核苷酸。
200、适当地，所述缀合物用于治疗以下疾病的任一种：杜氏肌营养不良症(dmd)、bucher肌营养不良症(bmd)、menkes病、β地中海贫血、痴呆、帕金森氏病、脊髓性肌萎缩症(sma)、强直性肌营养不良症(dm1或dm2)、亨廷顿舞蹈症、hutchinson-gilford早衰综合症、共济失调毛细血管扩张症、面肩肱型肌营养不良症(fshd)或癌症。
201、适当地，待治疗的患者或受试者可以是任何动物或人类。适当地，所述患者或受试者可以是非人类哺乳动物。适当地，所述患者或受试者可以是雄性或雌性。在一个实施方案中，所述受试者是雄性。
202、适当地，待治疗的患者或受试者可以是任何年龄。适当地，待治疗的患者或受试者的年龄为0-40岁，适当地为0-30岁，适当地为0-25岁，适当地为0-20岁。
203、适当地，所述缀合物用于全身施用于受试者，例如，通过髓内、鞘内、心室内、玻璃体内、肠内、肠胃外、静脉内、动脉内、肌内、肿瘤内、皮下、口服或经鼻途径。
204、在一个实施方案中，所述缀合物用于静脉内施用于受试者。
205、在一个实施方案中，所述缀合物用于通过注射静脉内施用于受试者。
206、适当地，所述缀合物以“治疗有效量”施用于受试者，对于此这是指该量足以显示出对个体的益处。实际施用的量以及施用的速率和时间过程将取决于所治疗疾病的性质和严重性。对剂量的决定由全科医生和其他医生负责。该技术和方案的示例可以在remington's pharmaceutical sciences,第20版,2000,pub.lippincott,williams&wilkins中找到。
207、示例性剂量可以为0.01mg/kg至50mg/kg、0.05mg/kg至40mg/kg、0.1mg/kg至30mg/kg、0.5mg/kg至18mg/kg、1mg/kg至16mg/kg、2mg/kg至15mg/kg、5mg/kg至10mg/kg、10mg/kg至20mg/kg、12mg/kg至18mg/kg、13mg/kg至17mg/kg。
208、有利地，本发明的缀合物的剂量比由单独施用治疗性分子起效所需的剂量低一个级别或数量级。
209、适当地，在施用本发明的缀合物之后，与使用当前可获得的细胞穿透肽的现有技术缀合物相比，一种或多种毒性标志物显著降低。
210、适当的毒性标志物可以是肾毒性标志物。
211、适当的毒性标志物包括kim-1、ngal、bun、肌酐、碱性磷酸酶、丙氨酸转移酶和天冬氨酸转氨酶。
212、适当地，在施用本发明的缀合物之后，与使用当前可获得的细胞穿透肽的现有技术缀合物相比，kim-1、ngal和bun中至少一种的水平降低。
213、适当地，在施用本发明的缀合物之后，与使用当前可获得的细胞穿透肽的现有技术缀合物相比，kim-1、ngal和bun中的每一种的水平均降低。
214、适当地，与使用当前可获得的细胞穿透肽的现有技术缀合物相比，每种标志物的水平均显著降低。
215、适当地，在施用本发明的缀合物之后，与使用当前可获得的细胞穿透肽的现有技术缀合物相比，所述或每种标志物的水平降低了至多5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％。
216、有利地，与现有的细胞穿透肽和缀合物相比，肽的毒性以及因此得到的缀合物的毒性显著降低。特别地，kim-1是毒性的标志物，并且与使用当前可获得的肽载体的现有技术缀合物相比，kim-1显著降低了至多30倍。
217、核酸和宿主
218、本发明的肽可以通过任何标准的蛋白质合成方法(例如化学合成、半化学合成)或通过使用表达系统来制备。
219、因此，本发明还涉及包含编码所述肽的dna或由其组成的核苷酸序列、表达系统(例如包含所述序列以及用于表达和控制表达所需的序列的载体)以及由所述表达系统转化的宿主细胞和宿主生物。
220、因此，还提供了编码根据本发明的肽的核酸。
221、适当地，所述核酸可以分离或纯化的形式提供。
222、还提供了包含编码根据本发明的肽的核酸的表达载体。
223、适当地，所述载体是质粒。
224、适当地，所述载体包含一个或多个调节序列(例如启动子)，其可操作地连接至编码根据本发明的肽的核酸。适当地，当转染到合适的细胞(例如哺乳动物、细菌或真菌细胞)中时，所述表达载体能够表达所述肽。
225、还提供了包含本发明的核酸或表达载体的宿主细胞。
226、可以根据可将本发明的核酸插入其中的宿主细胞来选择表达载体。宿主细胞的这种转化涉及常规技术，例如sambrook等人[sambrook,j.,russell,d.(2001)molecularcloning:a laboratory manual,cold spring harbor laboratory press,ny,usa]中教导的技术。选择适当的载体在本领域技术人员的能力范围内。适当的载体包括质粒、噬菌体、粘粒和病毒。
227、产生的肽可以通过任何适当的方法从宿主细胞中分离和纯化，所述方法例如沉淀或色谱分离，所述色谱例如亲和色谱。
228、适当的载体、宿主和重组技术是本领域众所周知的。
229、在本说明书中，术语“可操作地连接”可以包括这样的情况，其中所选择的核苷酸序列和调节性核苷酸序列以使核苷酸编码序列的表达处于调节序列的控制之下的方式共价连接，这样，所述调节序列能够影响形成部分或全部所选核苷酸序列的核苷酸编码序列的转录。然后在适当情况下，可以将所得的转录物翻译成所需的肽。