本发明涉及根据独立权利要求的前序部分所述的一种用于培养细胞的微流体装置、一种用于运行微流体装置的方法以及一种包含微流体装置的盒体。
背景技术：
1、在wo2019/010587a1中提出了一种带有腔体的微流体通道，在腔体中预存有水凝胶前体。细胞进入腔体进而进入水凝胶前体，水凝胶前体最终被固化。随后在形成的水凝胶球中进行细胞的培养。
2、实体肿瘤的癌症患者对药物抗癌治疗的反应差异很大。目前对癌症治疗的个性化需求极高，这尤其需要考虑单个患者的细胞特性等因素，以便能够制定出个体化的优化治疗方案。
3、近年来，人们对使用三维细胞聚集体(如类器官或球状体)来研究、诊断和治疗疾病(如肿瘤疾病)的兴趣大幅增加，因为这类三维细胞聚集体能够很好地再现器官特异性特征等。通常，这类三维细胞聚集体的操作需借助移液管、反应容器和实验室设备等辅助器具手动完成。相比传统实验室测试，微流体技术在此展现出诸多优点，例如所需样本体积和试剂量更少、分析时间缩短，以及能够实现并行过程等。然而，将所需工艺步骤集成到微流体系统中时，由于其复杂性，存在诸多需要克服的挑战。其中一项挑战例如是在微流体系统中培养和扩增这类三维细胞聚集体。
4、所谓的芯片实验室系统(简称loc系统)是微流体系统，其将宏观实验室的功能集成到塑料基板上，以实现自动化处理。这类系统能够使生化过程在很大程度上或完全自动化地进行处理。芯片实验室系统通常包括两个主要组件。第一个是测试载体，例如以盒体的形式，其包含用于操控所采集样本的结构和机制，特别是诸如通道、反应室或预存试剂等被动组件，或者也可以是阀门、泵或混合器等主动组件。第二个主要组件是用于控制盒体中的微流体流程的控制单元。
技术实现思路
1、为了研究肿瘤疾病，例如会使用所谓的肿瘤类器官。制造肿瘤类器官的一种方法是从癌症患者的原发肿瘤中提取单个细胞或组织碎片，随后进行培养。在此情况下，这些细胞或组织碎片会分化和扩增，最终自我组织成三维结构。由此产生的肿瘤类器官是三维细胞聚集体，其组成和结构与患者的原发肿瘤组织相似。借助肿瘤类器官，可以很好地再现体内的情况。目前，为了制造类器官或肿瘤类器官，采用已确立的3维细胞培养方法。在此情况下，主要工艺步骤有培养从原始材料中提取的细胞或组织碎片，以及随后扩增所生成的肿瘤类器官。
2、在培养过程中，细胞或细胞聚集体被悬浮在所谓的细胞外基质(ecm，英文：extracellular matrix)中。ecm例如是含有合适的内容物的水凝胶。这种悬浮液的液滴被移液到细胞培养容器(如多孔板)中，通过在37℃下孵育，发生凝胶聚合。在此情况下形成凝胶结构(英文：geldomes)。凝胶固化后，将合适的培养基移液到容器中，使凝胶结构被培养基完全覆盖。接下来进行培养箱中的培养阶段。在此过程中，细胞在凝胶结构内扩增，形成不同大小和形状的类器官。类器官的生长例如通过显微镜监测，并在合适的时间点开始类器官的传代。为此，将凝胶结构转移到另一个容器中，洗涤、破碎并重新悬浮类器官。随后进行类器官的扩增，将其解离成多细胞碎片或单个的细胞。这些培养和扩增的工艺步骤非常耗费人力和时间，只能由经过培训和有经验的专业人员在配备适当设备的实验室中进行。
3、本发明涉及细胞培养过程，例如三维细胞聚集体(尤其是类器官或球状体)的培养过程，这些培养过程被认为对微流体技术的实施极为关键，本发明还描述了一种以微流体方式实现与培养相关的工作步骤的技术方案。
4、根据本发明，提供了具有独立权利要求的特征的一种用于培养细胞的微流体装置，其包括带有至少一个腔体的通道，所述至少一个腔体用于容纳至少一个微颗粒，所述至少一个腔体从通道外表面向外突出，以及一种用于运行微流体装置的方法。
5、这尤其基于以下几点：微流体装置的至少一个腔体具有与泵单元连接的流体接口，该流体接口从通道向外引出。优选地，微流体装置具有多个腔体，每个腔体都具有与泵单元连接的流体接口。从通道外表面向外突出的腔体尤其可以理解为通道中的侧向凸起或凹陷，其特别是作为通道内壁中的凹缺部布置，用于容纳至少一个微颗粒。腔体的直径例如为200–1500μm，特别是400–750μm。腔体的形状和尺寸优选被选择为使得每个腔体中分别容纳一个微颗粒，并且后续流过来的微颗粒被运输至下一个空闲的腔体。替代地，腔体的尺寸也可以设计为能够容纳多个微颗粒。每个腔体都具有流体接口，该流体接口直接或通过适当连接的阀门与泵单元连接。由此可以从腔体中输出液体或将液体输入腔体。为此合适的泵单元例如是注射泵、隔膜泵或蠕动泵。
6、有利的是，流体接口使得能够在腔体内或微流体装置内实现流动诱导的过程。这通过经由各个流体接口将液体输入腔体或从腔体中输出液体来实现。例如，这使得能够通过经由流体接口输出液体来实现一个或多个微颗粒在腔体中经流动诱导的运动和定位。同样，微颗粒或其溶解后的成分(特别是细胞或三维细胞聚集体)可以通过经由流体接口供给液体而又从腔体被冲洗到通道中。此外，可以影响培养条件以及处于腔体内的微颗粒或处于微颗粒内的细胞和/或三维细胞聚集体的培养过程。这通过精确定量供给合适选择的液体来实现。由此，尤其是可以为每个腔体实现不同的培养条件，从而研究对细胞或三维细胞聚集体的行为或特性的影响。此外，通过经由至少一个腔体的流体接口供给合适的液体，还确保了含有微颗粒的腔体内始终存在培养所需的新鲜营养物质和气体。它们被引入至需要的地方，且不必通过通道或其他结构扩散至腔体内。因此，流体接口改善了待培养细胞的供给。此外有利的是，通过每个腔体的流体接口可以从腔体中取出定义体积的液体用于后续分析，从而可以监测培养过程并在必要时进行调整。
7、根据本发明的装置还具有以下优点：细胞和/或三维细胞聚集体的培养在微流体系统内部自动化进行，使得培养过程具有可重复性、可自动化、可标准化且操作友好。因此，无需经验丰富的专业人员和配备适当设备的实验室，从而减轻专业人员的负担并节省时间和成本。由于无需手动执行工艺步骤，因此例如不会出现由操作引起的影响或错误，并且可防止可能的污染物进入。特别地，三维细胞聚集体(如类器官)用于可靠药物测试时，标准化是必需的。
8、微流体装置的其他有利实施方式由从属权利要求得出。
9、在一个有利的实施方式中，至少一个腔体的流体接口具有集成的阻挡元件。替代地或附加地，至少一个腔体的流体接口的尺寸为5–75μm。在此有利的是，微颗粒的尺寸大于流体接口，或由于阻挡元件而无法通过流体接口，因此无法经由流体接口离开腔体。以此方式，可以在不损失微颗粒的情况下向腔体引入和引出液体。
10、此外有利的是，微流体装置的通道的尺寸为100–1000μm。在本发明的意义中，术语“尺寸”是指微流体通道的高度和/或宽度。
11、在另一有利的实施方式中，通道具有至少一个弯曲部，且至少一个腔体布置在通道弯曲部的外弧面上。在此有利的是，由于弯曲部的作用，通过通道输送的成分(例如微颗粒)会受到离心力作用，该离心力将成分向至少一个腔体方向运输并使其进入腔体。
12、在另一有利的实施方式中，所述装置具有用于对通道和/或至少一个腔体进行调温的装置。由此可以设定用于培养细胞和/或三维细胞聚集体的合适的温度。这例如通过调温(特别是在微流体装置下方)实现，例如通过使用一个或多个(特别是布置在微流体装置下方的)珀尔帖元件。
13、此外，在另一实施方式中有利的是，通道和/或至少一个腔体设计成至少部分光学透明的，并包括控制单元(特别是相机和/或显微镜单元)。在此有利的是，可以对细胞和/或三维细胞聚集体的培养过程进行光学观察。例如，可以获知经培养的三维细胞聚集体的尺寸，并在其达到定义尺寸时停止培养过程。
14、此外，在另一实施方式中有利的是，微流体装置包括至少一个用于流体的储液器，其与至少一个腔体的流体接口流体连接。储液器中预存有培养基、生长因子、营养物质和/或药理活性物质。这确保了培养基、生长因子、营养物质和/或药理活性物质的快速和简便的供给。
15、本发明的另一主题是使用根据本发明的微流体装置培养细胞的方法，包括以下步骤：
16、a)输送含有微颗粒的介质通过通道，其中，一个微颗粒包裹至少一个细胞，并将至少一个微颗粒引入至少一个腔体中。微颗粒例如在培养基中被运输。
17、b)对处于腔体中的微颗粒中的至少一个细胞进行培养，特别是培养成三维细胞聚集体。经由腔体的流体接口向腔体定量供给培养基、生长因子、营养物质和/或药理活性物质。培养过程中，周围的培养基扩散到腔体和微颗粒中，从而为细胞供给溶解的营养物质和气体。培养基例如通过微流体通道连续地或在确定的时间被继续输送。经由腔体的流体接口，在培养过程中向微颗粒(进而向细胞或三维细胞聚集体)供给相同或不同成分的新鲜培养基，使得消耗的培养基例如在确定的时间被新鲜培养基替代。替代地或附加地，精确定量供给生长因子、营养物质和/或药理活性物质。例如可以以定义的浓度添加不同的生长因子。
18、在此有利的是，以此方式可以有针对性地影响细胞或三维细胞聚集体的培养。培养基、生长因子、营养物质和/或药理活性物质经由流体接口直接进入腔体，从而到达其确定位置，以在培养过程中有针对性地作用于细胞或三维细胞聚集体。这确保了细胞或三维细胞聚集体以足够的浓度接触相应的培养基、生长因子、营养物质和/或药理活性物质。经由流体接口向腔体添加定义浓度的药物溶液，尤其是可以研究对培养过程和细胞或三维细胞聚集体特性的影响。例如，可以经由流体接口向腔体引入单一或多种浓度可选的化疗药物。此外有利的是，特别是可以为每个腔体实现不同的培养条件，从而研究对细胞或三维细胞聚集体行为或特性的影响。为了进行培养，将腔体例如调温到合适温度，例如到37℃。此外，也可以加热通道和腔体的流体接口。
19、c)终止培养，并将至少一个微颗粒或至少一个经培养的细胞，特别是三维细胞聚集体，从腔体引出到通道中。细胞或三维细胞聚集体培养过程的终止在可选的时间点进行，例如在三维细胞聚集体达到期望的尺寸或形态时。终止可以针对单个或多个腔体进行。最后，处于微流体通道中的微颗粒可以被继续运输和处理。
20、除了在各个方法步骤中已说明的优点外，这种方法还具有以下优点：细胞或三维细胞聚集体可用于后续的培养或分析步骤，特别是用于扩增或药物测试。此外，根据本发明的方法还具有以下优点：细胞和/或三维细胞聚集体的培养是自动化进行的，这使得培养过程具有可重复性、可自动化、可标准化且操作友好。由此得出已针对微流体装置描述的优点。
21、根据本发明的方法的其他有利实施方式由从属权利要求得出。
22、在一种有利的实施方式中，在步骤a)中基于流经通道时因通道弯曲部产生的作用于微颗粒的离心力，将至少一个微颗粒引入至少一个腔体中。在此，腔体布置在通道的外弧面上。在此有利的是，作用于微颗粒的离心力将微颗粒直接向至少一个腔体方向运输并使其进入腔体。
23、在一替代或附加的有利实施方式中，在步骤a)中通过经由腔体的流体接口输出培养基，以流动诱导的方式将至少一个微颗粒引入至少一个腔体中。在此有利的是，微颗粒由此以流动诱导的方式向腔体方向移动并在其中定位。
24、替代地或附加地，微颗粒在腔体中的移动和定位也可借助其他技术实现或辅助，例如借助介电泳和施加的非均匀电场来移动并捕获微颗粒，和/或借助施加磁场和微颗粒的磁性标记，和/或借助驻波超声波产生吸引并固定微颗粒的压力节点。
25、在另一有利的实施方式中，在步骤b)中改变经由腔体的流体接口供给的培养基中的氧气和/或二氧化碳含量。由此可在腔体内有利地实现缺氧培养条件，其表征了实体肿瘤的体内情况。
26、在另一有利的实施方式中，在步骤b)中在培养期间经由至少一个腔体的流体接口从腔体中输出液体体积，并检测确定的参数。这些参数例如是培养基中的ph值、葡萄糖和/或乳酸的浓度、培养基中的氧气和/或二氧化碳含量，和/或培养基中蛋白质(特别是细胞因子)的存在或浓度。在此有利的是，可在培养过程中进行分析和监测，而无需停止或干扰培养。此外，对特征性特性的检测可提前提供关于培养品质的信息，从而可直接在培养过程中调整培养条件。
27、此外，在另一实施方式中有利的是，在步骤c)中通过经由腔体的流体接口向通道方向产生液体流动来终止培养。由此，微颗粒周围的培养基被冲洗掉，从而停止培养过程。微颗粒本身或溶解后的微颗粒的细胞或三维细胞聚集体也可借助液体流动从腔体离开被运输到通道中。所供给的液体例如可以是培养基或缓冲液。有利的是，这些步骤可经由腔体的流体接口以流动诱导的方式完成，并且与仅经由通道引起的流动相比，可确保微颗粒或细胞及三维细胞聚集体几乎完全从腔体中引出。
28、在另一有利的实施方式中，微颗粒是包含至少一个细胞和/或三维细胞聚集体的、特别是球形的水凝胶结构。此外，三维细胞聚集体例如是类器官或球状体。作为水凝胶结构的水凝胶，优选使用matrigeltm(康宁公司)。替代地也可使用其他水凝胶，例如琼脂糖、明胶或聚乙二醇。水凝胶结构的大小被选择为可在其中培养一个或多个三维细胞聚集体，特别是类器官。特别适用于药物测试的肿瘤类器官的直径例如在100–750μm之间。
29、此外，在一种实施方式中有利的是，在步骤c)中水凝胶结构被解聚，并且细胞和/或三维细胞聚集体，特别是类器官或球状体，在腔体中释放。为了解聚，经由腔体的流体接口供给试剂。试剂例如具有引发或促进解聚的温度。
30、对于matrigel水凝胶，这种解聚试剂例如是corningtmdispase溶液(康宁公司)或corningtm细胞回收溶液(康宁公司)。替代试剂是例如包含胰蛋白酶或trypletmexpress酶(赛默飞世尔)的酶溶液。附加地或替代地，matrigeltm(康宁公司)的解聚可通过将温度降低至约4℃来实现。为此，例如通过腔体的流体接口和/或微流体装置的通道供给温度约为4℃的培养基。或者将微流体装置(特别是腔体)调温至约4℃的温度。
31、本发明的主题还包括一种盒体，特别是微流体盒体，例如如de102016222072a1或de102016222075a1中所述，其包括根据本发明的微流体装置。