一株高产香叶基香叶醇的重组解脂耶氏酵母菌及其构建方法和应用

本发明属于生物工程领域，尤其涉及一株高产香叶基香叶醇的重组解脂耶氏酵母菌及其构建方法和应用。

背景技术：

1、香叶基香叶醇是一种无环二萜醇，是产自美洲地区胭脂树种子的提取物，呈现淡黄色至淡黄绿色之间的油状物质。它不仅是香料、精油的重要成分之一，也是化学合成药剂和疏水性维生素如3-烯丙基香叶醇、维生素a和e的有价值的原料。同时，香叶基香叶醇还可以用于治疗溃疡、神经衰弱、皮肤老化、血栓、动脉粥硬化和免疫缺失等疾病，诱导多种肿瘤细胞系的凋亡。

2、香叶基香叶醇可通过反式8-羟基乙酸香叶酯的合成、反式8-溴代乙酸香叶酯的合成、9-砜基香叶基香叶醇的合成、香叶基香叶醇的合成这四步化学反应合成。但是化学合成法步骤繁琐，成本较高而且化学合成的形式通常是(e)-异构体和(z)-异构体的混合物。香叶基香叶醇也可通过从胭脂树种子中提取得到，但是植物提取法生长周期长，原料来源有限，因此具有较大限制，相比化学合成法和植物提取法而言，微生物发酵生长周期短且可全天候生产、产量稳定，能满足日益增长的市场需求。但是，现有技术中没有高产香叶基香叶醇的微生物。

技术实现思路

1、本发明的目的是提供一株高产香叶基香叶醇的重组解脂耶氏酵母菌，能够高效生成香叶基香叶醇。

2、本发明的再一目的是提供所述重组解脂耶氏酵母菌的构建方法，该方法高效，操作简单。

3、本发明的再一目的是提供所述重组解脂耶氏酵母菌在生产香叶基香叶醇中的应用。

4、本发明的目的采用如下技术方案实现：

5、一株高产香叶基香叶醇的重组解脂耶氏酵母菌，在解脂耶氏酵母基因组中插入内源3-羟基-3-甲基戊二酰coa还原酶表达盒和法尼基焦磷酸合酶表达盒，并且插入了异源二酰甘油焦磷酸磷酸酶表达盒、香叶基香叶基焦磷酸合酶表达盒、植物生长素受体f-box蛋白表达盒和生长素诱导降解序列后得到的。

6、在本发明中，所述3-羟基-3-甲基戊二酰coa还原酶和法尼基焦磷酸合酶编码基因来源于解脂耶氏酵母；异源二酰甘油焦磷酸磷酸酶是将来源于酿酒酵母的二酰甘油焦磷酸磷酸酶编码基因经密码子优化后所得；香叶基香叶基焦磷酸合酶编码基因是将核果果腐拟茎点菌来源的壳梭孢菌素二烯合酶第390到719位氨基酸的编码基因经密码子优化后所得；植物生长素受体f-box蛋白是将来源于水稻的植物生长素受体f-box蛋白的编码基因经密码子优化后所得；生长素诱导降解序列是将来源于拟南芥的生长素诱导降解序列的编码基因经密码子优化后所得。

7、在本发明中，所述各表达盒的启动子为解脂耶氏酵母的启动子ptef、php4d、ptefin、pyat1、pfba、pfbain、ppox2、ppot1或pgpd中的任意一种；所述终止子为解脂耶氏酵母的终止子txpr2t、tmig1t、tlip2t、tcyc1t、tpex3t、tpex10t或tpex20t中的任意一种。

8、在本发明中，所述表达盒的整合位点为解脂耶氏酵母的a08位点、inta位点、intc位点、intc2位点、intc3位点、intd位点、inte2位点、intf位点、lip1位点或scp2位点中的任意一种。

9、在本发明中，所述酿酒酵母异源二酰甘油焦磷酸磷酸酶(dpp1)编码基因序列如seq id no：1所示；所述香叶基香叶基焦磷酸合酶(ggpps1)编码基因序列如seq id no：2所示；所述植物生长素受体f-box蛋白(tirs)编码基因序列如seq id no：3所示；所述生长素诱导降解序列(aid)编码基因序列如seq id no：4所示；

10、本发明还提供所述重组解脂耶氏酵母菌的构建方法，包括将3-羟基-3-甲基戊二酰coa还原酶表达盒、法尼基焦磷酸合酶表达盒、异源二酰甘油焦磷酸磷酸酶表达盒、香叶基香叶基焦磷酸合酶表达盒、植物生长素受体f-box蛋白表达盒和生长素诱导降解序列通过质粒形式导入所述解脂耶氏酵母，然后通过同源重组整合在解脂耶氏酵母基因组上的步骤。

11、本发明还提供所述重组菌在生产香叶基香叶醇中的应用，包括采用发酵培养基培养所述重组菌，得到发酵产物的步骤。

12、在本发明中，所述发酵培养基含有葡萄糖50-70g/l，蛋白胨15-25g/l，酵母膏8-12g/l，接种后添加发酵培养基体积8-12％的十二烷。

13、有益效果：解脂耶氏酵母中香叶基香叶醇合成途径代谢图如图1。本发明高产香叶基香叶醇的重组解脂耶氏酵母菌，是基于敲除负责编码非同源重组基因ku70的解脂耶氏酵母，使其同源重组能力增强，通过解脂耶氏酵母自身的同源重组功能实现基因的整合，能大幅度提高导入基因的遗传稳定性。本发明高产香叶基香叶醇的重组解脂耶氏酵母菌过表达内源法尼基焦磷酸合酶(erg20)和3-羟基-3-甲基戊二酰coa还原酶(thmg)，过表达异源二酰甘油焦磷酸磷酸酶(dpp1)、香叶基香叶基焦磷酸合酶1(ggpps1)表达盒、植物生长素受体f-box蛋白(tirs)和生长素诱导降解序列(aid)。本发明重组解脂耶氏酵母菌能够高效发酵生产香叶基香叶醇，实现了天然产物香叶基香叶醇在解脂耶氏酵母菌中的合成。本发明重组解脂耶氏酵母构建方法高效，操作简单。

技术特征：

1.一株高产香叶基香叶醇的重组解脂耶氏酵母菌，其特征在于是在解脂耶氏酵母基因组中插入内源3-羟基-3-甲基戊二酰coa还原酶表达盒和法尼基焦磷酸合酶表达盒，并且插入了异源二酰甘油焦磷酸磷酸酶表达盒、香叶基香叶基焦磷酸合酶表达盒、植物生长素受体f-box蛋白表达盒和生长素诱导降解序列后得到的。

2.根据权利要求1所述生产香叶基香叶醇的重组解脂耶氏酵母菌，其特征在于所述3-羟基-3-甲基戊二酰coa还原酶和法尼基焦磷酸合酶编码基因来源于解脂耶氏酵母；异源二酰甘油焦磷酸磷酸酶是将来源于酿酒酵母的二酰甘油焦磷酸磷酸酶编码基因经密码子优化后所得；香叶基香叶基焦磷酸合酶编码基因是将核果果腐拟茎点菌来源的壳梭孢菌素二烯合酶第390到719位氨基酸的编码基因经密码子优化后所得；植物生长素受体f-box蛋白是将来源于水稻的植物生长素受体f-box蛋白的编码基因经密码子优化后所得；生长素诱导降解序列是将来源于拟南芥的生长素诱导降解序列的编码基因经密码子优化后所得。

3.根据权利要求2所述重组解脂耶氏酵母菌，其特征在于所述各表达盒的启动子为解脂耶氏酵母的启动子ptef、php4d、ptefin、pyat1、pfba、pfbain、ppox2、ppot1或pgpd中的任意一种；所述终止子为解脂耶氏酵母的终止子txpr2t、tmig1t、tlip2t、tcyc1t、tpex3t、tpex10t或tpex20t中的任意一种。

4.根据权利要求3所述重组解脂耶氏酵母菌，其特征在于所述表达盒的整合位点为解脂耶氏酵母的a08位点、inta位点、intc位点、intc2位点、intc3位点、intd位点、inte2位点、intf位点、lip1位点或scp2位点中的任意一种。

5.根据权利要求4所述重组解脂耶氏酵母菌，其特征在于所述酿酒酵母异源二酰甘油焦磷酸磷酸酶(dpp1)编码基因序列如seq id no：1所示；所述香叶基香叶基焦磷酸合酶(ggpps1)编码基因序列如seq id no：2所示；所述植物生长素受体f-box蛋白(tirs)编码基因序列如seq id no：3所示；所述生长素诱导降解序列(aid)编码基因序列如seq id no：4所示。

6.权利要求1所述重组解脂耶氏酵母菌的构建方法，其特征在于包括将3-羟基-3-甲基戊二酰coa还原酶表达盒、法尼基焦磷酸合酶表达盒、异源二酰甘油焦磷酸磷酸酶表达盒、香叶基香叶基焦磷酸合酶表达盒、植物生长素受体f-box蛋白表达盒和生长素诱导降解序列通过质粒形式导入所述解脂耶氏酵母，然后通过同源重组整合在解脂耶氏酵母基因组上的步骤。

7.权利要求1-6中任一所述重组菌在生产香叶基香叶醇中的应用，其特征在于包括采用发酵培养基培养权利要求1-7中任一所述重组菌，得到发酵产物的步骤。

8.根据权利要求7所述重组菌在生产香叶基香叶醇中的应用，其特征在于所述发酵培养基含有葡萄糖50-70g/l，蛋白胨15-25g/l，酵母膏8-12g/l，接种后添加发酵培养基体积8-12％的十二烷。

技术总结
本发明提供一株高产香叶基香叶醇的重组解脂耶氏酵母菌及其构建方法和应用，属于生物工程领域。一株高产香叶基香叶醇的重组解脂耶氏酵母菌，在解脂耶氏酵母基因组中插入内源3‑羟基‑3‑甲基戊二酰CoA还原酶表达盒和法尼基焦磷酸合酶表达盒，并且插入了异源二酰甘油焦磷酸磷酸酶表达盒、香叶基香叶基焦磷酸合酶表达盒、植物生长素受体F‑box蛋白表达盒和生长素诱导降解序列后得到的。本发明高产香叶基香叶醇的重组解脂耶氏酵母菌，能够高效生成香叶基香叶醇。

技术研发人员：纪晓俊,殷明雪,王凯峰,林璐,黄和
受保护的技术使用者：南京工业大学
技术研发日：
技术公布日：2024/3/31