用于小麦株高性状鉴定的分子标记及其应用

本发明属于小麦育种，涉及用于小麦株高性状鉴定的分子标记及其应用。

背景技术：

1、小麦是世界上最重要的粮食作物之一，其重要性不仅体现在食品生产和全球经济上，还在社会、文化和历史方面具有深远的影响。小麦作为主要食品来源：小麦是世界各地人们的主要食品来源之一，它提供了大约20％的全球膳食热量。小麦被用于制作面包、面条、饼干、糕点等各种主食，满足了数十亿人的主要能量需求。小麦影响全球粮食供应：小麦在全球粮食供应链中扮演着关键角色。它是世界上最广泛种植的粮食作物之一，为各种食品加工和人类消费提供了大量原材料。小麦的重要性不仅在于它作为主要食品来源，还在于它对全球经济、农业和文化的深远影响。它是人类社会的不可或缺的一部分，对于满足申请人的基本需求和丰富申请人的生活方式至关重要。

2、小麦是全球最重要的主粮作物，为人类食物热量的主要来源，株高又是影响小麦产量的一个重要因素，株高关乎着小麦的抗倒伏能力，相对较矮的株高，往往拥有较为较低的重心，从而表现出更强的抗倒伏能力。上世纪为了减少小麦倒伏情况，引入rht1和rht2使小麦植株更加紧凑和坚挺，使得小麦在使用高水肥的情况下，减少了倒伏的风险。这有助于减少收割时的损失，提高产量和农民的经济效益。但据以往研究报道，rht1和rht2可能导致幼苗出苗不良，并对千粒重(tgw)和每穗粒数(kn)有负面影响。因此，进一步挖掘并研究既能够降低植株高度，又不影响作物产量的株高基因，对于小麦的育种生产实际应用十分的重要。

3、竞争性等位基因特异性pcr，通常称为kasp技术，是一种基于pcr过程的创新方法，用于检测snp(单核酸多态性)。这项技术以引物末端碱基的特异性配对为基础，实现了对基因型的高精度分析，同时还具备高产能、成本低、高效、准确性高以及遗传稳定性强的特点。kasp技术在小型到中等规模的标记应用中表现出卓越的经济性和高度的可扩展性。

4、因此，基于kasp技术来探索和鉴定适用于小麦株高特性的kasp分子标记，以供选择矮秆和半矮小麦品种之用，对于小麦高产育种的辅助选择具有重要的战略意义。

技术实现思路

1、有鉴于此，本发明的目的在于提供用于小麦株高性状鉴定的分子标记及其应用。

2、为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：

3、1、用于小麦株高性状鉴定的分子标记，包括：

4、kasp-erft，共由137个核酸组成，用于鉴定t/t基因型(高杆基因型)，其核苷酸序列如下：

5、gaaggtgaccaagttcatgctgacccgacgaaggaggagttctgggagcagttccgtagctccgatgaggagtagtttatctagtagtttgaataagtagtagttgaagttgatttatgaaactatgttgaatggac，如seqid no.1所示；

6、kasp-erfc，共由137个核酸组成，用于鉴定c/c基因型(矮杆基因型)，其核苷酸序列如下：

7、gaaggtcggagtcaacggattgacccgacgaaggaggagtcctgggagcagttccgtagctccgatgaggagtagtttatctagtagtttgaataagtagtagttgaagttgatttatgaaactatgttgaatggac，如seqid no.2所示。

8、2、用于小麦株高性状鉴定的引物组合物，即taerf基因的第533位核酸是否由“c”变异为“t”，包括以下上游引物或至少一种下游引物的组合：

9、下游引物kasp-erf-fam-f：

10、gaaggtgaccaagttcatgctgacccgacgaaggaggagtt，如seq id no.3所示；

11、下游引物kasp-erf-hex-f：

12、gaaggtcggagtcaacggattgacccgacgaaggaggagtc，如seq id no.4所示；

13、上游引物kasp-erf-l：gtccattcaacatagtttcataaat，如seq id no.5所示；

14、taerf基因的核苷酸序列如seq id no.6所示。

15、作为优选的技术方案之一，所述引物组合物选自以下任一种：

16、kasp-erf-fam-f和kasp-erf-l的组合，用于扩增和检测taerf基因的第533位核酸，该位点的基因型为t/t；

17、kasp-erf-hex-f和kasp-erf-l的组合，用于扩增和检测taerf基因的第533位核酸，该位点的基因型为c/c；

18、kasp-erf-fam-f、kasp-erf-hex-f和kasp-erf-l的组合，用于扩增和检测taerf基因的第533位核酸，该位点的基因型为t/c。

19、3、用于小麦株高性状鉴定的试剂盒，包含前述的引物组合物。

20、作为优选的技术方案之一，所述试剂盒还包含pcr扩增所需的成分，如taq dna聚合酶、dntp、pcr缓冲液以及mg2+等。

21、4、前述分子标记、引物组合物或试剂盒在小麦株高性状鉴定或协助鉴定中的应用。

22、作为优选的技术方案之一，通过检测taerf基因的第533位核酸是否由“c”变异为“t”，来鉴定小麦株高性状。

23、5、前述分子标记、引物组合物或试剂盒在小麦育种中的应用。

24、作为优选的技术方案之一，前述分子标记、引物组合物或试剂盒在抗倒伏小麦品种育种中的应用。

25、6、一种鉴定或协助鉴定小麦株高性状的方法，利用前述的引物组合物进行kasp反应，生成pcr产物；根据pcr产物的荧光信号来确定待鉴定小麦taerf基因的第533位核酸是否发生“c”到“t”的突变，从而鉴定小麦株高性状。

26、7、一种鉴定或协助鉴定小麦taerf矮杆基因变异类型的方法，包括以下步骤：

27、(1)检测待测小麦的taerf基因位点第533位脱氧核糖核酸的基因型，判断是t/t,或者是c/c型，亦或是t/c；

28、(2)基于步骤(1)的检测结果，确定待测小麦的基因型是否为c/c基因型(包括erfc等位类型，矮杆类型)，该类型的小麦株高低于t/t基因型(erft等位类型)，或者t/c基因型(erfc/erft等位类型)的小麦，其中c/c基因型指的是taerf基因的第533位脱氧核糖核酸为c的纯合体，而t/t基因型指的是taerf基因的第533位脱氧核糖核酸为t的纯合体，而t/c基因型指的是taerf基因的第533位脱氧核糖核酸为t/c的杂合体。

29、作为优选的技术方案之一，所述的株高性状是成熟期小麦的株高，也就是说，在步骤(2)中，c/c基因型的待测小麦的株高明显低于t/t基因型或t/c基因型的待测小麦的株高。

30、作为优选的技术方案之一，步骤(1)的检测步骤包括：

31、(1-1)使用待测小麦的基因组dna作为模板，采用前述的引物组合物进行pcr扩增，然后对扩增产物进行荧光信号扫描。

32、(1-2)基于所获得的荧光信号，确定待测小麦taerf基因的第533位核酸的基因型，即是t/t型还是c/c型亦或是t/c型。

33、作为进一步优选的技术方案之一，步骤(1-1)中，利用如下的pcr体系实现pcr扩增，总体积为8μl：100ng/l模板dna 1.0μl，2×kasp反应混合液4.0μl，引物组合物2.0μl，双蒸水1.0μl；其中，2×kasp反应混合液(北京嘉程生物科技公司)包括荧光探针a、荧光探针b、淬灭探针a、淬灭探针b，以及高保真的taq酶和dntp等。

34、作为更进一步优选的技术方案之一，所述引物组合物为kasp-erf-fam-f、kasp-erf-hex-f和kasp-erf-l的组合，三者的体积比为1：1：2.5。

35、作为进一步优选的技术方案之一，步骤(1-1)中，采用touch down pcr扩增程序，具体步骤如下：首先，在95℃下进行10分钟的预变性；接着，进行touch down程序，包括：在95℃下进行20秒的变性，然后在61℃下进行40秒的退火和延伸，循环执行10次，每个循环中的退火温度下降0.6℃；最后，进行扩增程序，包括：在95℃下进行20秒的变性，然后在55℃下进行40秒的退火，总共进行33个循环；pcr产物需要在4℃下避光保存。

36、作为进一步优选的技术方案之一，步骤(1-1)中，pcr扩增过程在常用的pcr扩增设备上进行，例如long gene-a300 pcr扩增仪。这一步骤会生成pcr扩增产物。接下来，可以使用常见的实时定量仪器，比如bio-rad c1000 touch thermal cycler，根据荧光信号进行基因分型。

37、作为进一步优选的技术方案之一，步骤(1-2)中，荧光信号的判断步骤可以通过使用bio-rad cfx maestro软件来实现；根据荧光信号进行基因型判断，具体如下：如果待测小麦的pcr扩增产物的荧光信号数据经过软件分析呈现蓝色(hex荧光信号)，则待测小麦的变异位点的基因型为c/c型；如果待测小麦的pcr扩增产物的荧光信号数据经过软件分析呈现橙色(fam荧光信号)，则待测小麦的变异位点的基因型为t/t型；如果待测小麦的pcr扩增产物的荧光信号数据经过软件分析呈现绿色(fam/hex荧光信号)，则待测小麦的变异位点的基因型为t/c型。

38、8、一种小麦育种方法，利用待鉴定小麦的基因组dna为模板，通过pcr扩增，获得pcr产物，然后选择包含前述分子标记的pcr产物，将其作为亲本进行育种。

39、作为优选的技术方案之一，小麦育种的目标包括培育矮秆小麦品种和/或中等矮秆小麦品种。

40、作为优选的技术方案之一，选择erfc基因型(c/c基因型)的小麦品种作为矮源，进行矮化育种，以获得目标矮杆小麦品种。

41、本发明的有益效果在于：

42、传统方法用于品种鉴定或种子质量评估通常成本高昂，鉴定周期长。但是，kasp技术能够有效地解决这两个问题，大大降低了育种成本，同时显著缩短了鉴定周期。因此，kasp技术被广泛视为分子育种工作中品种鉴定和种子质量控制的首选技术。

43、传统的矮杆基因标记并不能完全与性状连锁，因为这些传统的分子标记的开发并不能精准地以矮杆基因来开发，分子标记可能距离矮杆基因的物理距离很远，而两者之间的距离会在植物体内产生性状与标记的不连锁，如传统分子标记显示为矮杆类型，但是真实的矮杆基因单倍型缺失高杆类型，这是体内在进行染色体交叉互换所引起的，而为了避免传统分子标记所遇到的性状与分子标记的不连锁所造成的生产育种中所引起的“无用功”甚至改良性状失败。

44、本发明通过图位克隆方法一步步挖掘到真正控制该染色体区段内的真正控制株高性状的主效基因taerf，从而根据该基因的关键变异位点开发功能性分子标记，这种根据主效基因开发的分子标记才能做到与矮杆性状的完全连锁，而不会出现基因型与表现型的分离，从而将该种精准的分子标记应用到育种中，去筛选出携带矮杆基因单倍型的亲本，将其作为矮杆基因片段供体，与携带高杆基因的待改良亲本进行杂交以将其高杆基因替换为矮杆基因从而达到降杆增加抗倒伏性的目的。

45、小麦在不同染色体上有多个不同的矮杆位点，不同的矮杆基因具有不同的效应，有的会大幅度降杆，但是也会带来一定的负效应，如rht1、rht2所带来的千粒重的下降，胚芽鞘长度下降导致破土能力的下降。所以需要挖掘更多的新型的矮杆基因，去降低传统的矮杆基因所带来的负效应。本发明通过克隆了5a染色体长臂上的一个新的未报道过的控制株高，穗长的基因taerf，在实验中证明该矮杆基因对单株产量并没有显著的影响，

46、本发明为全新的独立的调控信号通路，可在传统的矮杆基因的基础上仍可进一步降杆。新型的矮杆基因所引起的矮杆效应可以独立于传统矮杆基因之外，产生累加效应，去除了传统分子标记所标识的矮杆基因可能处于相同通路而造成基因不能产生叠加效应的弊端。即使在rht1和rht2的存在情况下仍然能够保证降杆效应，为育种家提供了新的矮杆基因用于分子标记辅助选择育种。

47、本发明公开了一个与小麦株高性状相关的变异位点，并通过该位点开发了kasp标记和专用引物。采用这一kasp标记和专用引物，可以确定待测小麦的基因型，即erft基因型(变异位点为t/t)或erfc基因型(变异位点为c/c)或erft/erfc基因型(变异位点为t/c)。对96份小麦样本的单倍型分析结果表明，根据待测小麦的基因型，可以从中确定具有erfc基因型的小麦品种作为矮源品种进行矮化育种，这一发现有助于筛选出株高矮化，抗倒伏的小麦品种，为培育高产、稳产、矮杆、抗倒伏的小麦品种提供了理论基础，并提供了分子辅助选择的工具。

48、利用本发明的kasp分子标记能够以高速、高精度、高通量的方式鉴定taerf基因的矮杆类型。它具备高效检测和跟踪小麦品种/品系中的taerf基因，有助于加速矮杆基因taerf在小麦育种中的高效利用。该分子标记可在小麦各个组织和各个发育阶段进行检测，甚至可在小麦苗期进行筛选，从而加快小麦的遗传改良进程。这一创新的kasp分子标记引物具有高度准确性、极强的特异性，以及简便经济的检测方法，能够显著提高品种品质改良的选择效率。

49、本发明还公开了相应的pcr引物，这些引物能够扩增小麦基因组dna片段，其中包括小麦taerf基因的第533位核苷酸，在鉴定或协助鉴定小麦株高性状中，利用“c”到“t”的核酸突变作为标志性特征的物质得以应用。该方法有望显著提高小麦株高性状的鉴定效率和准确性。

50、本发明中的kasp基因分型是指一种特殊的竞争型等位基因特异性pcr，用于高精度双等位基因分型，可用于各种基因组dna样本，包括复杂基因组的样本，也可用于验证经过性状定位得到的候选标记，如snp和indel，以及重测序数据等。

51、引物末端碱基特异匹配是kasp技术的基础，用于进行snp分型和indels检测。因为snp技术具有出色的灵活性，因此它的应用范围广泛，适用于各种基因分型研究。无论是低通量研究项目、ngs后的snp验证，还是农业种群研究等，snp技术都可以派上用场。