融合基因测序文库的制备方法及应用与流程

本发明涉及基因检测，具体涉及一种融合基因测序文库的制备方法及应用。

背景技术：

1、融合基因是指两个基因的全部或一部分的序列相互融合为一个新的基因的过程，其有可能是染色体易位、中间缺失或染色体倒置所致的结果。目前，多项研究表明基因融合可能与各种癌症的发生发展紧密相关，这些融合基因还可能是潜在的药物靶点，需要进行检测。

2、目前，检测融合基因的技术路线通常包括文库构建步骤：提取样本的rna，打断成小片段，逆转录生成cdna，再生成cdna二链，末端修复，连接测序接头，纯化，pcr扩增得到一定浓度的文库，利用捕获融合基因的panel探针进行过夜杂交，进行洗脱后再次pcr扩增得到上机所需要的文库浓度。

3、上述常规文库构建步骤繁琐且实验流程冗长，反馈效率低。另外，医院病理科收集的组织常常为使用福尔马林固定石蜡包埋处理后的切片，核酸降解严重，需要足够多的样本才能提取出足量的rna用于建库测序。

技术实现思路

1、基于此，有必要提供一种融合基因测序文库的制备方法及应用，可以显著缩短测序文库构建的实验流程，同时只需要从样本种提取出微量的rna即可满足测序文库制备的要求。

2、本发明采用如下技术方案：

3、本发明提供一种测序文库的制备方法，包括如下步骤：获取样本，提取所述样本中的rna，逆转录生成cdna，将带umi标签序列的接头包埋在tn5酶上，采用带包埋接头的tn5酶进行酶切，酶切缺口补平，加入index引物进行pcr扩增，dna clean beads磁珠纯化回收；采用探针panel杂交捕获，链霉亲和素磁珠纯化回收；再次pcr扩增，纯化回收，即得。

4、在其中一些实施例中，所述逆转录生成cdna所要求的rna投入量不低于1ng。

5、在其中一些实施例中，所述逆转录生成cdna的步骤为：使用oligo-dt和随机引物在逆转录酶的作用下生成cdna，反应程序为：25℃，10～25min；37～50℃，30～60min；80℃，5～10min。

6、所述将带umi标签序列的接头包埋在tn5酶上的步骤为：

7、将带umi标签的第一接头序列与转座酶识别序列互补序列退火形成第一接头，带umi标签的第二接头序列与转座酶识别序列互补序列退火形成第二接头，所述转座酶识别序列互补序列具有转座酶识别序列-反向(me-r，即转座酶识别序列互补序列)所示的碱基序列；所述第一接头序列具有primer-a所示的碱基序列；所述第二接头序列具有primer-b所示的碱基序列；其中，

8、me-r：

9、5’-phos-ctgtctcttatacacatct-3’，phos为磷酸化修饰；

10、primer-a：

11、5’-tcgtcggcagcgtcagatgtgtataagagacagnnnnnn-3’；

12、primer-b：

13、5’-gtctcgtgggctcggagatgtgtataagagacagnnnnnn-3’；

14、n碱基为a、t、c、g中的一种。

15、在其中一些实施例中，采用带包埋接头的tn5酶进行酶切的参数条件为：加入tn5酶，55℃孵育，然后加入一定浓度的sds水溶液(优选为0.2～0.4％)，室温孵育。

16、在其中一些实施例中，所述酶切缺口补平的步骤为：加入bst酶和dna高保真聚合酶，72℃孵育10～15min，95℃加热使bst酶失活。

17、在其中一些实施例中，所述加入index引物进行pcr扩增的程序为：98℃预变性3min；98℃变性20s，60℃退火15s，72℃延伸30s，循环8～12次；72℃终延伸3min。

18、在其中一些实施例中，所述采用探针panel杂交捕获的孵育温度为60～65℃，孵育时间2h。

19、在其中一些实施例中，所述样本为含有融合基因的组织样本。

20、上述所述测序文库的制备方法可以在二代测序融合基因中进行应用。

21、与现有技术相比，本发明的核心优势在于：

22、相比常规包括将rna打断的文库构建方法，本发明融合基因测序文库的制备方法的实验流程简化且效率较高，同时对样本核酸投入量要求降低至1ng的rna。

技术特征：

1.一种测序文库的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

2.根据权利要求1所述测序文库的制备方法，其特征在于，所述逆转录生成cdna所要求的rna投入量不低于1ng。

3.根据权利要求1或2所述测序文库的制备方法，其特征在于，所述逆转录生成cdna的步骤为：使用oligo-dt和随机引物在逆转录酶的作用下生成cdna，反应程序为：25℃，10～25min；37～50℃，30～60min；80℃，5～10min。

4.根据权利要求1或2所述测序文库的制备方法，其特征在于，所述酶切的参数条件为：加入包埋接头的tn5酶，55℃孵育，然后加入sds水溶液，室温孵育。

5.根据权利要求1或2所述测序文库的制备方法，其特征在于，所述酶切缺口补平的步骤为：加入bst酶和dna高保真聚合酶，72℃孵育10～15min，95℃加热使bst酶失活。

6.根据权利要求1或2所述测序文库的制备方法，其特征在于，所述加入index引物进行pcr扩增的程序为：

7.根据权利要求1或2所述测序文库的制备方法，其特征在于，所述采用探针panel杂交捕获的孵育温度为60～65℃。

8.根据权利要求1或2所述测序文库的制备方法，其特征在于，所述样本为含有融合基因的组织样本。

9.权利要求1至8任一项所述测序文库的制备方法在二代测序融合基因中的应用。

技术总结
本发明提供一种融合基因测序文库的制备方法及应用。该测序文库的制备方法包括如下步骤：获取组织样本，提取样本的RNA，逆转录生成cDNA，采用包埋UMI接头的Tn5酶进行酶切，酶切缺口补平，加入index引物进行PCR扩增，磁珠纯化回收后杂交，链霉亲和素磁珠纯化回收后再次PCR扩增，纯化回收即得。相比常规包括将RNA打断的文库构建方法，本发明融合基因测序文库的制备方法的实验流程简化且效率较高，同时对样本核酸投入量要求降低至1ng的RNA；相比较常规的Tn5转座酶建库，本方法由于给文库加上了UMI序列，有利于消除PCR扩增带来的错误率，使检测结果更精准。

技术研发人员：李彬,何彬,郭琼钰,周雪,王蓉,李拼,曹现涛,魏光,侯龙辉,陆亚平
受保护的技术使用者：国药（武汉）精准医疗科技有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/4/17