乳腺癌的诊断标志物及其在乳腺癌治疗中的应用

本发明属于生物，具体涉及一种乳腺癌的诊断标志物及其在乳腺癌治疗中的应用。

背景技术：

1、乳腺癌(breast cancer，bc)是世界范围内女性最常见的恶性肿瘤之一，发病率呈逐年上升趋势。乳腺癌的常见治疗手段包括手术、放疗、化疗、内分泌治疗和免疫治疗等，然而有大量乳腺癌患者在采用上述方法治疗的过程中产生耐药，导致治疗失败和肿瘤复发。乳腺癌干细胞(breast cancer stem cells，bcscs)是一种通过不对称细胞分裂增殖和分化的肿瘤细胞亚群，同时也是治疗耐药性的主要原因。因此，临床迫切需要更好地了解乳腺癌治疗抵抗与bcscs干细胞维持之间的调控机制，以提高乳腺癌治疗效果。

2、低氧微环境对肿瘤的恶性进展有深远的影响，包括干细胞维持和化疗耐药。同时低氧反应非编码rna，特别是长链非编码rna (long non-coding rna，lncrna)，已被证明通过多种机制在控制癌细胞恶性行为中发挥多种作用。我们之前的工作阐明了一种新的低氧lncrna kb-1980e6.3通过稳定c-myc mrna在bcscs干细胞维持中的作用。然而，低氧lncrna在癌症恶性进展中的机制仍在很大程度上尚未揭示。此外，lncrnas在蛋白质功能中也起着至关重要的调节作用，如蛋白质活性的调节，蛋白质定位的改变，以及在亚细胞结构中参与rna-蛋白复合物的形成。同时，现有研究表明，lncrnas通过影响蛋白质的翻译后修饰如泛素化、磷酸化、乙酰化等来促进癌症的进展。然而，lncrna与类泛素化修饰(包括sumoylation、neddylation和isgylation)之间相互作用的潜在机制尚不清楚。因此，有必要深入研究lncrna在调节蛋白质修饰方面的功能，寻找有关肿瘤的发展和改善临床治疗效果的有用线索。

3、遗传信息的准确传递需要mrna的有效输出和严格的调控。编码参与癌细胞恶性过程的蛋白质的rna从细胞核的输出需要尽可能快速和稳定地进行。核输出过程需要mrna输出因子，包括识别适配器以及转运体,以确保mrna快速通过核膜通道。最近的研究焦点集中在人类癌症中失调的mrna输出因子。例如，乳腺癌细胞中核输出适配器htrex84的升高可以促进mrna输出和细胞增殖。细胞核中pi3k信号通过alyref介导的mrna输出功能协调细胞增殖。此外，有报道称rna修饰特别是n6-甲基腺苷(m6a)对rna生物学过程包括rna核输出至关重要。例如，依赖m6a的mrna核输出对于神经和破骨细胞分化至关重要。然而，m6a修饰的mrna核输出在恶性肿瘤中的机制仍不明确。

4、因此，亟需深入研究和阐明bc恶性进展和化疗耐药的分子机制，以寻找bc的有效治疗策略。

技术实现思路

1、有鉴于此，本发明的目的之一在于提供一种乳腺癌的诊断标志物，本发明研究证实，低氧诱导的pcat6在乳腺癌患者中高表达且与乳腺癌的进展和不良预后有关。

2、为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

3、乳腺癌的诊断标志物，所述诊断标志物为低氧诱导的pcat6。

4、进一步，所述低氧诱导的pcat6在ensemble数据库中的基因编号为enst00000417262。

5、本发明的目的之二在于提供一种低氧诱导的pcat6作为诊断标志物在制备用于乳腺癌诊断的产品中的应用。

6、为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

7、低氧诱导的pcat6作为诊断标志物在制备用于乳腺癌诊断的产品中的应用，所述产品包括用于检测低氧诱导的pcat6的表达水平的试剂。

8、本发明的目的之三在于提供一种抑制剂在制备用于预防或治疗乳腺癌的药物中的应用，本发明研究发现pcat6与乳腺癌进展相关，可以通过抑制pcat6表达从而对乳腺癌进行预防或治疗。

9、为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

10、一种抑制剂在制备用于预防或治疗乳腺癌的药物中的应用，所述抑制剂包括m6a抑制剂、抑制pcat6表达的试剂、抑制hnrnpa2b1表达的试剂、抑制alyref表达的试剂中的任一种或多种。

11、进一步，所述hnrnpa2b1在ensemble数据库中的基因编号为enst00000618183.5；所述alyref在ensemble数据库中的基因编号为enst00000505490.3。

12、进一步，所述抑制pcat6表达的试剂包括靶向pcat6的shrna，所述抑制hnrnpa2b1表达的试剂包括靶向hnrnpa2b1的shrna和/或hnrnpa2b1小分子抑制剂，所述抑制alyref表达的试剂包括靶向alyref的shrna和/alyref小分子抑制剂，所述m6a抑制剂包括特异性抑制剂stm2457；所述靶向pcat6的shrna的核苷酸序列如seq id no.1或seq id no.2所示；所述靶向hnrnpa2b1的shrna的核苷酸序列如seq id no.3所示；所述靶向alyref的shrna的核苷酸序列如seq id no.4所示。

13、进一步，所述特异性抑制剂stm2457信息如下：mce,cat.no.hy-134836。

14、本发明的目的之四在于提供一种前述抑制剂在制备用于抑制乳腺癌干细胞干性维持和/或提升乳腺癌化疗药物敏感性的药物中的应用，本发明研究证实，pcat6与乳腺癌干细胞干性相关，pcat6通过抑制乳腺癌干细胞干性从而实现预防或治疗乳腺癌，且与乳腺癌化疗药物的耐药性息息相关。

15、为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

16、前述抑制剂在制备用于抑制乳腺癌干细胞干性维持和/或提升乳腺癌化疗药物敏感性的药物中的应用。

17、进一步，所述抑制剂包括m6a抑制剂、抑制pcat6表达的试剂、抑制hnrnpa2b1表达的试剂、抑制alyref表达的试剂中的任一种或多种。

18、作为优选，所述抑制pcat6表达的试剂包括靶向pcat6的shrna，所述抑制hnrnpa2b1表达的试剂包括靶向hnrnpa2b1的shrna和/或hnrnpa2b1小分子抑制剂，所述抑制alyref表达的试剂包括靶向alyref的shrna和/alyref小分子抑制剂，所述m6a抑制剂包括特异性抑制剂stm2457；所述靶向pcat6的shrna的核苷酸序列如seq id no.1或seq idno.2所示；所述靶向hnrnpa2b1的shrna的核苷酸序列如seq id no.3所示；所述靶向alyref的shrna的核苷酸序列如seq id no.4所示。

19、进一步，所述抑制剂通过抑制m6a修饰rna的核输出，抑制乳腺癌干细胞的干性维持和化疗药物耐药。

20、进一步，所述乳腺癌化疗药物包括阿霉素、吡柔比星、表柔比星、紫杉醇、环磷酰胺中的任一种或多种。

21、本发明的目的之五在于提供一种前述抑制剂在制备通过抑制isg15与hnrnpa2b1的相互作用、抑制alyref与hnrnpa2b1的相互作用和/或促进hnrnpa2b1泛素化降解以治疗乳腺癌的药物中的应用。

22、为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

23、前述抑制剂在制备通过抑制isg15与hnrnpa2b1的相互作用、抑制alyref与hnrnpa2b1的相互作用和/或促进hnrnpa2b1泛素化降解以治疗乳腺癌的药物中的应用。

24、进一步，所述抑制剂包括m6a抑制剂、抑制pcat6表达的试剂、抑制hnrnpa2b1表达的试剂、抑制alyref表达的试剂中的任一种或多种。

25、作为优选，所述抑制pcat6表达的试剂包括靶向pcat6的shrna，所述抑制hnrnpa2b1表达的试剂包括靶向hnrnpa2b1的shrna和/或hnrnpa2b1小分子抑制剂，所述抑制alyref表达的试剂包括靶向alyref的shrna和/alyref小分子抑制剂，所述m6a抑制剂包括特异性抑制剂stm2457；所述靶向pcat6的shrna的核苷酸序列如seq id no.1或seq idno.2所示；所述靶向hnrnpa2b1的shrna的核苷酸序列如seq id no.3所示；所述靶向alyref的shrna的核苷酸序列如seq id no.4所示。

26、本发明的目的之六在于提供一种体外调节乳腺癌干细胞的干性特征以及乳腺癌干细胞对乳腺癌化疗药物敏感性的方法，该方法不以疾病治疗或诊断为目的，而是用于乳腺癌发生机制的研究，进一步研发治疗药物。

27、为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

28、一种体外调节乳腺癌干细胞的干性特征以及乳腺癌干细胞对乳腺癌化疗药物敏感性的方法，所述方法为：

29、1)敲低乳腺癌干细胞中的pcat6或抑制乳腺癌干细胞中pcat6的表达，减弱乳腺癌干细胞干性特征，增加乳腺癌干细胞对药物的敏感性；

30、或2)过表达乳腺癌干细胞中的pcat6，促进乳腺癌干细胞干性维持，增加乳腺癌干细胞对药物的耐药性；

31、所述乳腺癌干细胞干性维持的特征包括m6a修饰的mrna的核输出、乳腺癌干细胞成球率、乳腺癌干细胞大小、cd44+cd24-/low干细胞亚群和/或干性相关基因的表达；所述m6a修饰的mrna包括fgfr1、hif-1a、brca1、smad4、pi3k、dvl1、wnt5a和stat6。

32、本发明的目的之七在于提供一种体外抑制乳腺癌干细胞和/或肿瘤的方法，该方法不以疾病治疗或诊断为目的，而是用于体外实验，进一步探索乳腺癌发生机制，研发治疗药物。

33、为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

34、一种体外抑制乳腺癌干细胞和/或肿瘤的方法，采用如下方法或试剂中的一种或多种与化疗药物联用，抑制乳腺癌干细胞和/或肿瘤的发展；

35、1)敲低或敲除乳腺癌干细胞中的pcat6或抑制乳腺癌干细胞中pcat6的表达；

36、2)alyref小分子抑制剂；

37、3)hnrnpa2b1小分子抑制剂；

38、4)m6a抑制剂；

39、5)敲除乳腺癌干细胞中的isg15或抑制乳腺癌干细胞中isg15的表达。

40、本发明的目的之八在于提供一种用于治疗乳腺癌的药物组合物。

41、为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

42、用于治疗乳腺癌的药物组合物，所述药物组合物包括m6a抑制剂、抑制pcat6表达的试剂、抑制hnrnpa2b1表达的试剂、抑制alyref表达的试剂中的任一种或多种。

43、进一步，所述抑制pcat6表达的试剂包括靶向pcat6的shrna，所述抑制hnrnpa2b1表达的试剂包括靶向hnrnpa2b1的shrna和/或hnrnpa2b1小分子抑制剂，所述抑制alyref表达的试剂包括靶向alyref的shrna和/alyref小分子抑制剂，所述m6a抑制剂包括特异性抑制剂stm2457；所述靶向pcat6的shrna的核苷酸序列如seq id no.1或seq id no.2所示；所述靶向hnrnpa2b1的shrna的核苷酸序列如seq id no.3所示；所述靶向alyref的shrna的核苷酸序列如seq id no.4所示。

44、进一步，所述药物组合物还包括乳腺癌化疗药物；所述乳腺癌化疗药物包括阿霉素、吡柔比星、表柔比星、紫杉醇、环磷酰胺中的任一种或多种。

45、本发明的有益效果在于：

46、1.本发明研究发现m6a修饰的mrna在恶性乳腺癌细胞中存在差异分布，进一步证实在乳腺癌中，低氧相关lncrna pcat6的增强可促进m6a修饰的mrna核输出，从而促进癌症干细胞的干性特征维持和阿霉素耐药，这为m6a介导的mrna核输出有助于癌症进展和治疗耐药提供了线索。

47、2.本发明研究发现低氧相关lncrna pcat6在乳腺癌中高表达，并且与乳腺癌恶性进展和化疗耐药密切相关。机制上，pcat6作为isg15和hnrnpa2b1之间的支架分子，导致hnrnpa2b1的isgylation修饰，从而保护hnrnpa2b1蛋白免受泛素化介导的蛋白酶体降解。此外，作为m6a阅读器，hnrnpa2b1不仅可以识别m6a修饰的mrna，还可以通过alyref/nxf1复合物选择性地介导m6a修饰的mrna核输出，从而促进干性特征维持相关基因在乳腺癌中的表达。敲低hnrnpa2b1或抑制mrna核输出均可导致与干细胞维持相关的m6a修饰的mrna在细胞核滞留，从而抑制bcsc自我更新，有效提高阿霉素等化疗药物的疗效。本发明证明了m6a修饰的mrna核输出在乳腺癌进展中的关键作用，抑制m6a标记的mrna及其核输出是改善癌症化疗的潜在治疗策略。

48、3.本发明研究证实了m6a特异性抑制剂stm2457联合短发夹rna(short hairpinrna，shrna)靶向pcat6或hnrnpa2b1可有效抑制m6a修饰的mrna的核输出，抑制bcsc的恶性表型。这些新发现将有助于了解乳腺癌的肿瘤进展、化疗耐药和m6a修饰mrna的病理生物学。