一种引物对、试剂盒及其在识别中药材及其加工品以及在鉴别中成药中植物基原中的应用的制作方法

本发明涉及中药鉴别，尤其涉及一种引物对、试剂盒及其在识别中药材及其加工品以及在鉴别中成药中植物基原中的应用。

背景技术：

1、姜科植物温郁金(curcuma wenyujin)、姜黄(curcuma longa)、广西莪术(curcumakwangsiensis)或蓬莪术(curcuma phaeocaulis)是中药材姜黄、莪术、郁金和片姜黄的植物来源。中药材姜黄为植物姜黄经蒸煮至透心后干燥的根茎；中药材莪术为植物广西莪术、温郁金或蓬莪术经蒸煮至透心后干燥的根茎；中药材郁金为植物温郁金、姜黄(习称黄丝郁金)、广西莪术(习称桂郁金)或蓬莪术(习称绿丝郁金)经蒸煮至透心后干燥的块根；中药材片姜黄是植物温郁金趁鲜切片干燥的根茎。不同的植物来源、用药部位和炮制方法，使上述四种中药材的功能主治各有不同，例如：姜黄以治气滞血瘀所致的心胸胁腹诸痛为宜，片姜黄善治风湿肩臂疼痛；莪术具有行气破血、消积止痛的功效，适用于治疗气滞血瘀所致的胸痹心痛、脘腹胀痛、癥瘕积聚、食积胀痛、瘀血经闭、跌打损伤等病症，郁金具有行气化瘀，清心解郁，利胆退黄的功效，用于经闭痛经，胸腹胀痛、刺痛，热病神昏，癫痫发狂，黄疸尿赤。对于同一中药材，不同植物基原含有不同的成分，功效也随之存在差异，例如对于郁金来说，根据研究显示，黄丝郁金的降血脂活性最强，而对于十二指肠平滑肌的肌张力和振幅的影响，黄丝郁金和绿丝郁金表现为抑制作用，桂郁金为兴奋作用，温郁金则随着浓度的增加表现为先兴奋后抑制。可见，在临床应用时，药材的基原选择会对疾病的预防、治疗效果产生影响。因此，无论是直接以饮片形式进行临床应用还是加工为中成药，准确鉴定中药材的植物来源都十分必要，对临床应用的有效性具有重要意义。目前鉴别上述中药材基原的方法往往只能鉴别上述四种植物基原中的两种或三种，尚无能够同时满足四种植物基原鉴别的方法。

技术实现思路

1、针对以上技术问题，本发明提供了一种引物对、试剂盒及其在识别中药材及其加工品以及在鉴别中成药中植物基原中的应用。本发明提供的引物对能够特异性扩增姜黄、温郁金、广西莪术、蓬莪术的特征序列，从而能够给中药材姜黄、郁金、莪术和片姜黄饮片及其加工品的识别以及中成药中植物基原的鉴别提供数据支持，可用于以上中药材及含以上中药材的中成药的质量监控。

2、为达到上述发明目的，本发明采用了如下的技术方案：

3、第一方面，本发明提供一种引物对，包括由seq id no.1所示的上游引物和seq idno.2所示的下游引物。

4、seq id no.1的序列为：5′-tgtcatagggtatgtatacatatgcgt-3′；

5、seq id no.2的序列为：5′-tgttccttttagccgttatcca-3′。

6、以上引物对是基于对温郁金、广莪术、蓬莪术、姜黄的叶绿体基因组的研究后，针对自行选择的高变异区域的核苷酸序列经人工设计得到的，在扩增所得特征序列中，变异位点稳定存在，进而能够根据变异位点快速、准确地辅助识别姜黄、莪术、郁金和片姜黄饮片以及中成药中以上四种中药材的植物基原，具有实用性和经济性等优点，能够为以上四种中药材的基原控制及中成药中的药材基原控制提供数据支持。

7、第二方面，本发明还提供一种试剂盒，包括由seq id no.1所示的上游引物和seqid no.2所示的下游引物组成的引物对。

8、结合第二方面，所述试剂盒还包括pcr缓冲液、dna聚合酶和模板dna，所述pcr缓冲液中含有镁离子和脱氧核苷三磷酸(dntp)。

9、以上pcr缓冲液和dna聚合酶均可选择用于pcr扩增的市售试剂，例如，可选用宝日医生物技术有限公司的gflextm buffer和tks gflextm dna polymerase。模板dna为待测样品的总dna。

10、第三方面，本发明还提供了上述试剂盒在识别中药材饮片及其加工品中的应用，所述中药材包括姜黄、莪术、郁金和片姜黄。

11、结合第三方面，所述应用的具体步骤包括：

12、s1、提取待测样品的总dna；

13、s2、以所述总dna为模板dna，用上述引物进行pcr扩增，根据扩增结果进行所述中药材的鉴别。

14、优选地，所述pcr扩增的反应体系为：

15、

16、扩增反应条件为：98℃，1min；98℃，10s，52℃，15s，68℃，30s，30个循环；68℃，5min。

17、在该pcr扩增的反应体系中，模板dna的浓度可根据pcr扩增的效果进行常规调整。

18、第四方面，本发明还提供了上述试剂盒在鉴别中成药中的植物基原中的应用，所述植物基原包括姜黄、温郁金、广西莪术和蓬莪术。

19、结合第四方面，所述应用的具体步骤包括：

20、s1、提取待测样品的总dna；

21、s2、以所述总dna为模板dna，用上述引物进行pcr扩增，根据扩增结果进行中成药中的所述植物基原的鉴别。

22、优选地，所述pcr扩增的反应体系为：

23、

24、扩增反应条件为：98℃，1min；98℃，10s，62℃，15s，68℃，30s，30个循环；68℃，5min。

25、在该pcr扩增的反应体系中，模板dna的浓度可根据pcr扩增的效果进行常规调整。

技术特征：

1.一种引物对，其特征在于，包括由seq id no.1所示的上游引物和seq id no.2所示的下游引物。

2.一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括由seq id no.1所示的上游引物和seq idno.2所示的下游引物组成的引物对。

3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括pcr缓冲液、dna聚合酶和模板dna，所述pcr缓冲液中含有镁离子和脱氧核苷三磷酸。

4.权利要求2或3所述的试剂盒在识别中药材饮片及其加工品中的应用，其特征在于，所述中药材包括姜黄、莪术、郁金和片姜黄。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，具体步骤包括：

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述pcr扩增的反应体系为：

7.权利要求2或3所述的鉴别郁金的试剂盒在鉴别中成药中的植物基原中的应用，其特征在于，所述植物基原包括姜黄、温郁金、广西莪术和蓬莪术。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，具体步骤包括：

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述pcr扩增的反应体系为：

技术总结
本发明涉及中药鉴别技术领域，尤其涉及一种引物对、试剂盒及其在识别中药材及其加工品以及在鉴别中成药中植物基原中的应用。本发明提供的引物对由SEQ ID NO.1所示的上游引物和SEQ ID NO.2所示的下游引物组成，该引物对能够特异性扩增姜黄、温郁金、广西莪术、蓬莪术的特征序列，从而能够辅助识别由以上植物制成的中药材饮片及其加工品，并能鉴别中成药中的以上植物，可进一步用于药材的基原鉴别及中成药的质量监控。

技术研发人员：于冰,田晓轩,特努克古丽·吐列别克,冯锐
受保护的技术使用者：天津市中心妇产科医院
技术研发日：
技术公布日：2024/4/22