一种生物菌剂及其制备方法与应用

本发明涉及土壤改良，特别涉及一种生物菌剂及其制备方法与应用。

背景技术：

1、土壤碳库是生态系统中最大的碳库，调控土壤固碳减排过程、增强土壤固碳能力是实现“碳中和”的有力途径，也是提高土壤肥力，提升粮食生产水平的重要措施。土壤中有机碳的移动性强，不同组分有机碳的分解能力相差很大，降低土壤有机碳的移动性，调控土壤有机碳向更稳定的方向转化，增加土壤对有机碳的固定对减少温室气体排放和实现碳中和具有重要意义。

2、铁是土壤中含量最丰富的元素之一，对土壤有机碳的稳定性影响很大。溶解态铁元素通过络合作用与有机碳结合，会提高有机碳活性，加速有机碳的转化和分解。无定形铁矿物具有较大的比表面积，通过表面吸附作用能固定较多的有机碳。结晶态的铁矿物可以通过吸附作用将有机碳固定在矿物表面，降低有机碳的移动性和释放；或通过共沉淀作用将有机碳固定在矿物缺陷或纳米孔洞中，减少微生物与有机碳的接触，降低其降解速率，从而将有机碳长期封存在土壤中。cn 115746866 a“一种利用纳米级赤铁矿促进土壤碳增汇的方法”，提供了一种通过向土壤中添加纳米赤铁矿促进土壤增碳的方法，但纳米铁矿物存在吸附上限，吸附饱和后难以持续发挥作用，且纳米矿物的成本很高，不适用于大面积推广。cn 101407437a“一种抑制有机物料矿化释放二氧化碳的方法”，通过向有机材料中加入氢氧化铁胶体合成复合材料抑制二氧化碳排放，但氢氧化铁胶体的造价较高，且直接加入到土壤中可能造成环境的负面效应。同时，现阶段使用的专利中也有其它弊端。一方面，直接向土壤中添加的铁矿物仅能通过吸附作用固定有机碳，对有机碳的封存作用较弱，短期固定的有机碳很容易再次释放到环境中；另一方面，土壤中已经存在大量铁矿物，继续投加铁矿物对土壤固碳能力的提升非常有限。因此，提供一种土壤有机碳长效和持久性封存的新方法具有重要意义。

技术实现思路

1、本发明旨在至少解决现有技术中存在的上述技术问题之一。为此，本发明的目的之一在于提供一种生物菌剂；本发明的目的之二在于提供这种生物菌剂的制备方法；本发明的目的之三在于提供这种生物菌剂的应用。

2、为了实现上述目的，本发明所采取的技术方案是：

3、本发明的第一方面提供了一种生物菌剂，为负载有具有亚铁氧化能力微生物的颗粒载体。

4、优选地，所述具有亚铁氧化能力的微生物包括acidovorax sp.、pseudogulbenkiania sp.、klebsiella pneumoniae中的至少一种；其中，acidovorax sp.购买于德国菌种保藏中心，pseudogulbenkiania sp.和klebsiella pneumoniae购买于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号分别为810296和810178；在本发明一些优选的实施例中，所述具有亚铁氧化能力的微生物为acidovorax sp.bofen1(简称bofen1，购买于德国菌种保藏中心，该菌公开于中国专利cn 117000756 a)。

5、优选地，所述颗粒载体包括由以下组分制备而成：粉煤灰、莫来石粉、二水氯化钙、酸液。

6、优选地，所述粉煤灰、莫来石粉、二水氯化钙的质量比为(60～190):(3～20):1；进一步优选地，所述粉煤灰、莫来石粉、二水氯化钙的质量比为(90～94):(5～10):1。

7、优选地，所述粉煤灰的粒径为50～110目；进一步优选地，所述粉煤灰的粒径为40～100目。

8、优选地，所述莫来石粉的粒径为90～110目；进一步优选地，所述莫来石粉的粒径为95～105目。

9、优选地，所述酸液包括氨基磺酸、硫酸中的至少一种，酸化使菌剂具有多孔结构；在本发明一些优选的实施例中，酸液的配制方法为：将氨基磺酸与硫酸混合，最后定容至1.0l，即得所述酸液；所述硫酸的浓度为17～19mol/l；所述氨基磺酸质量份与硫酸体积份的比值为1g:(3～6)ml。

10、优选地，所述酸液的浓度为1.2～1.7mol/l；进一步优选地，所述酸液的浓度为1.3～1.6mol/l。

11、优选地，所述粉煤灰、莫来石粉、二水氯化钙总质量与酸液的固液比为1g:(10～20)ml；进一步优选地，所述粉煤灰、莫来石粉、二水氯化钙总质量与酸液的固液比为1g:(13～15)ml。

12、本发明的第二方面提供了本发明第一方面所述生物菌剂的制备方法，包括以下步骤：

13、1)将粉煤灰、莫来石粉、二水氯化钙混合均匀，酸化，得到颗粒载体；

14、2)将所述颗粒载体与具有亚铁氧化能力的微生物共培养，即得所述生物菌剂。

15、优选地，所述步骤1)中，酸化时辅以振荡，所述振荡的速率为180～300rpm，时间为5～7h。

16、优选地，所述步骤1)中，酸化结束后还包括清洗及干燥所述颗粒载体的步骤；所述清洗所用的试剂为去离子水；所述清洗的次数为3～4次；所述干燥的温度为60～80℃。

17、优选地，酸化后颗粒载体的比表面积为1.5～2.5m2/g；进一步优选地，酸化后颗粒载体的比表面积为1.5～2.0m2/g。

18、优选地，所述步骤2)中，颗粒载体与微生物共培养前，还包括加入缓冲液、氧脱除和灭菌的步骤。

19、优选地，所述缓冲液包括硼砂-硼酸缓冲液、磷酸盐缓冲液；在本发明一些优选的实施例中，所述缓冲液为硼砂-硼酸缓冲液。

20、优选地，所述颗粒载体与缓冲液的固液比为1g:(10～20)ml；进一步优选地，所述颗粒载体与缓冲液的固液比为1g:(13～15)ml。

21、优选地，所述氧脱除的具体方式为氮气曝气。

22、优选地，所述灭菌的温度为121℃；灭菌压力为103kpa。

23、优选地，所述步骤2)中，具有亚铁氧化能力的微生物通过活化培养得到；所述微生物活化培养包括培养液配制和菌种活化培养。

24、优选地，所述培养液的营养成分包括0.2～0.4g/l醋酸钠、0.3～0.5g/l硝酸钠、0.05～0.12g/l无水氯化钙、0.10～0.15g/l磷酸二氢钾、0.3～0.45g/l氯化镁、0.2～0.3g/l氯化钾、0.15～0.3g/l氯化铵和8～10g/l1-4-哌嗪二乙磺酸。

25、优选地，所述培养液ph值为6.5～7.5；在本发明一些优选的实施例中，使用盐酸和氢氧化钠调节ph值。

26、优选地，所述培养液配制完成后进行氧脱除和灭菌；所述氧脱除的具体方式为氮气曝气；所述灭菌的温度为121℃；灭菌的压力为103kpa。

27、优选地，所述菌种活化培养的方式为：于28～35℃下厌氧避光培养20～24h；再于29～31℃下厌氧避光强化培养10～12h，能使微生物具有高反应活性。

28、优选地，所述菌种活化培养后离心菌液获得菌种沉淀，并使用ph为7.0～7.5的缓冲液清洗3～4次，即得所述具有亚铁氧化能力的微生物；将所述具有亚铁氧化能力的微生物重悬浮于缓冲液，即得所述具有亚铁氧化能力的微生物菌液；在本发明一些优选的实施例中，缓冲液为硼砂-硼酸缓冲液。

29、优选地，所述步骤2)中，具有亚铁氧化能力的微生物的细菌密度为od600＝0.35～0.50。

30、优选地，所述步骤2)中，颗粒载体与具有亚铁氧化能力的微生物的固液比为1g:(0.8～1.2)ml；进一步优选地，颗粒载体与具有亚铁氧化能力的微生物的固液比为1g:(0.9～1.1)ml。

31、优选地，所述步骤2)中，颗粒载体与具有亚铁氧化能力的微生物共培养的温度为20～30℃；进一步优选地，温度为22～27℃。

32、优选地，所述步骤2)中，颗粒载体与具有亚铁氧化能力的微生物共培养的时间为2～6h；进一步优选地，时间为3～5h。

33、优选地，所述步骤2)中，共培养时辅以振荡；所述振荡的速率为200～300rpm。

34、优选地，所述步骤2)中，共培养后还包括离心培养体系中溶液，获得生物菌剂的步骤。

35、本发明的第三方面提供了本发明第一方面所述生物菌剂在土壤改良中的应用。

36、优选地，所述生物菌剂与土壤的质量比为1:(200～300)；进一步优选地，所述生物菌剂与土壤的质量比为1:(230～270)。

37、优选地，所述土壤改良为提升土壤碳汇能力。

38、优选地，所述土壤含有铁矿物；进一步优选地，所述土壤的理化性质包括以下至少一项：ph值为4.0～8.0；总铁含量为15～30g/kg；有机碳含量为13～33g/kg；阳离子交换量为10～27cmol/kg。

39、与现有技术相比，本发明的有益效果是：

40、1)本发明以粉煤灰和具有亚铁氧化能力的微生物为主要原料合成生物菌剂，成分简单，粉煤灰为工业固废，造价低，环境友好，所得生物菌剂不仅可为有机碳提供充足的贮存空间，还能有效促进土壤中亚铁氧化过程和次生矿物生成过程，调控土壤有机碳向更稳定的形态转化，增强土壤有机碳与矿物结合的稳定性。

41、2)本发明提供的生物菌剂的制备方法简单，通过酸化增大颗粒载体的比表面积，使材料具有多孔结构，为微生物定殖和有机碳储存提供充足的空间。

42、3)本发明提供的生物菌剂应用于提升土壤碳汇能力，能够适用于不同ph环境的土壤，并能够在多种环境条件下保持有机碳固存的长期稳定。