一种以多肽为底物的颗粒酶B响应型组装体及其制备方法和应用

本发明涉及生物医学工程材料领域，尤其涉及一种以多肽为底物的颗粒酶b响应型组装体及其制备方法和应用。

背景技术：

1、传统的免疫学评估方法主要包括活检的组织学诊断和血液(或尿液)样本的生化分析。然而这些体外方法是侵入性的，且没有时空信息。而体内成像无论是在临床检测还是作为研究工具来说，对于实时观察体内情况都带来了巨大的便利。其中，核磁共振弛豫成像(mri)展现出较大的优势，主要包括：该成像方式是非入侵式的；对人体没有电离辐射损伤；可获得多方位的图像，提供更丰富的影像信息且易于临床转化。为了提高成像对比度，呈现更好的成像效果，通常需要引入造影剂。

2、钆相关造影剂作为一种t1造影剂，可以提供较为明亮的阳性信号，但其生物安全性较低。大量证据表明，钆相关造影剂具有较强的肾毒性，可导致肾原性系统纤维化，fda对钆相关造影剂提出了“黑框警告”。因此，对gd(iii)进行螯合及组装，减少其肾代谢，成为一个新的研究方向。

3、此外，传统非响应型组装体作为mri造影剂无论是否到达目标组装，均会产生信号，可能出现假阳，其在体内的成像效果受到极大的限制。

技术实现思路

1、发明目的：本发明的目的是提供一种以多肽为底物的颗粒酶b响应型组装体，主要引入酶响应型的多肽，使其组装成具有颗粒酶b响应的纳米组装体，使其具有较好的生物安全性及较好的成像效果；本发明的另一目的是提供一种以多肽为底物的颗粒酶b响应型组装体的制备方法；本发明的另一目的是提供一种以多肽为底物的颗粒酶b响应型组装体的应用。

2、技术方案：本发明的一种以多肽为底物的颗粒酶b响应型组装体，所述颗粒酶b响应型组装体通过具有两亲性的化合物自组装而成；两亲性的化合物以酶响应的底物多肽为连接，该多肽的一端连接有亲水性化合物，多肽的另一端连接有疏水性化合物，疏水性化合物内螯合有gd(iii)；其中，亲水性化合物为含有羧基的亲水聚合物，该羧基用于与上述多肽连接；疏水性化合物为螯合剂，富含o、n且可提供配位电子，配位电子用于与gd(iii)形成配位键，该疏水性化合物含有羧基或酯键用于与上述多肽连接；上述多肽为包含颗粒酶b底物在内的一段多肽序列，其羧基端或两端含有多余的氨基酸作为反应位点。

3、作为优选，亲水性化合物为末端修饰羧基的聚乙二醇，聚丙烯酸中的一种或几种，

4、疏水性化合物可与氨基或巯基反应，同时富n、o等含有孤对电子可与gd(iii)形成配位键的原子。作为优选，疏水性化合物为原卟啉，次卟啉，血卟啉，间卟啉，粪卟啉，尿卟啉，酚卟啉，二氢卟吩e6，脱镁叶绿素a及其衍生物中的一种或几种。

5、作为优选，多肽为包含颗粒酶b底物(包括但不限于iefd，iepd)在内的一段多肽序列，其羧基端或两端含有多余的氨基酸以提供氨基(赖氨酸，精氨酸)或巯基(半胱氨酸)作为反应位点。

6、作为优选，亲水性化合物为末端修饰羧基的聚乙二醇，疏水性化合物为原卟啉，多肽为pep，具有如下化学结构：

7、

8、本发明中，以多肽为底物的颗粒酶b响应型组装体通过化学反应将亲水端与疏水螯合剂连接到pep两端，该pep是组装体具有酶响应性的关键。其中，反应产生的两亲性的化合物具有两亲性，在剧烈搅拌或超声的作用下，可通过亲疏水作用力自组装，形成纳米组装体。

9、优选地，两亲性的化合物具有如下化学结构：

10、

11、本发明中亲疏水作用力组装的以多肽为底物的颗粒酶b响应型组装体具有较好的亲水性及稳定性。首先，该组装体具有纳米级尺寸，可以通过高通透性和滞留效应(epr效应)长期聚集在肿瘤部位，产生on的信号。当肿瘤部位免疫被激起时，细胞毒性t淋巴细胞(ctl)产生颗粒酶b，颗粒酶b识别并剪切底物pep，组装体部分解组装且亲水性减弱，产生off的信号；相比于肿瘤免疫产生的部位，未激起肿瘤免疫的部位在一定时间内则不会产生明显的信号减弱，从而达到肿瘤免疫成像的目的，在一定程度上增强了成像的对比度及灵敏度。

12、优选地，以多肽为底物的颗粒酶b响应型组装体的粒径为100±10nm

13、另一方面，本发明提供一种上述的以多肽为底物的颗粒酶b响应型组装体的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

14、1)将亲水性的化合物1与底物多肽pep连接，得到化合物3；化合物1为含有羧基的亲水聚合物；底物多肽的一端含有氨基或巯基；

15、2)将化合物3与化合物2连接，得到化合物4；化合物2为疏水性化合物，可作为螯合剂且含有羧基或酯键基团，羧基或酯键基团用于与底物多肽连接；

16、3)将化合物4溶于与gdcl3·6h2o搅拌，使gd(iii)与螯合剂充分螯合，得到化合物5；

17、4)化合物5通过亲疏水作用自组装，形成以多肽为底物的颗粒酶b响应型组装体。

18、进一步地，步骤1)中，合成化合物3的反应为酰胺反应，或，巯基和羧基的加成反应。

19、进一步地，化合物3合成方法为：将亲水性化合物1与催化剂溶于n,n-二甲基甲酰胺中，充分活化后，缓慢滴加至溶于n,n-二甲基甲酰胺的pep中，在室温下进行反应，待反应完全后，进行分离提纯，得到化合物3。

20、作为优选，催化剂为2-(7-氮杂苯并三氮唑)-n,n,n',n'-四甲基脲六氟磷酸酯，1-羟基苯并三唑，1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺/n-羟基丁二酰亚胺，2-乙氧基-1-乙氧碳酰基-1,2-二氢喹啉中的任意一种。

21、进一步地，步骤2)中，合成化合物4的反应为羧基和氨基的酰胺反应、巯基和羧基的加成反应、酯基和氨基的氨解反应、卤素和巯基的亲核取代反应、卤素和氨基的亲核取代反应中任意一种反应。

22、进一步地，化合物4合成方法为：将化合物2与催化剂溶于n,n-二甲基甲酰胺中，充分活化后，将溶于n,n-二甲基甲酰胺的化合物3缓慢滴加至反应体系，在室温下进行反应，待反应完全后，进行分离提纯，得到化合物4。

23、进一步地，步骤3)中，将化合物4溶于良溶剂中，再与溶于水的gdcl3·6h2o在室温下搅拌，待反应完全后，进行分离提纯，得到化合物5。

24、作为优选，步骤3)中，良溶剂为水，甲醇，n,n-二甲基甲酰胺，二甲亚砜，乙醇等中的一种或几种。

25、步骤4)中，自组装方法为两相混合法，将化合物5溶于除水之外的良溶剂中，滴加入水中，超声或超声破碎或剧烈搅拌进行组装，减压蒸馏或透析除去良溶剂。

26、作为优选，良溶剂包括甲醇，n,n-二甲基甲酰胺，二甲亚砜，乙醇，二氯甲烷，三氯甲烷等。

27、另一方面，本发明提供一种上述的以多肽为底物的颗粒酶b响应型组装体在制备造影剂中的应用。

28、具体的，本发明提供一种如上述的以多肽为底物的颗粒酶b响应型组装体在制备肿瘤及肿瘤免疫核磁共振弛豫成像造影剂中的应用。

29、本发明以多肽为底物的颗粒酶b响应型组装体具备良好的生物相容性和成像效果，在肿瘤免疫响应的部位产生显著核磁共振弛豫成像信号变化。

30、有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下显著优点：(1)本发明中的以多肽为底物的颗粒酶b响应型组装体具有纳米级粒径，可以长期滞留在肿瘤部位产生on的信号，而当肿瘤部位产生免疫响应后，细胞毒性t淋巴细胞成熟产生颗粒酶b，颗粒酶b识别并剪切底物肽，使该组装体结构改变，信号减弱。本发明中以多肽为底物的颗粒酶b响应型组装体可以实现由on到off的信号变化，大大减少了假阳性发生的概率。

31、(2)本发明中的反应条件温和，步骤简单，所制备的以多肽为底物的颗粒酶b响应型组装体具有较好的稳定性。

32、(3)本发明中，使用含螯合剂的化合物4将gd(iii)螯合，并形成纳米组装体，利用其较好的成像效果的同时，大大降低了gd(iii)导致的肾毒性的可能，具有较好的生物相容性，因此有潜在临床转化的可能性。