一种人乳铁蛋白肽三聚体融合蛋白及其制备方法和应用

本发明属于基因工程领域，特别涉及一种人乳铁蛋白肽三聚体融合蛋白及其制备方法和应用。

背景技术：

1、乳铁蛋白是乳汁中一种重要的非血红素铁结合糖蛋白，具有广谱抗菌，抗病毒感染作用，能调节体内铁的平衡；调节骨髓细胞的生成；促进细胞的生长；调节机体免疫功能，增强机体抗病能力；抑制人体肿瘤细胞的作用；能同多种抗生素及抗真菌制剂协同作用。

2、自青霉素发现以来，抗生素开始在全球广泛应用，人类逐渐进入控制和治疗微生物感染性疾病的时代。然而各种抗生素的滥用导致致病菌快速进化，造成耐药菌的大量出现，但是抗生素的研发却跟不上耐药菌进化速度。具有多种生物学功能的抗菌肽被发现具有抗菌谱广、抗菌活性高、不易产生抗药性、作用机理独特，热稳定性和水溶性好，对高等动物的正常细胞几乎无毒害作用。人乳铁蛋白肽是由人乳铁蛋白水解得到的多种具有不同生理功能的活性多肽，因其良好的生物学功能近年来备受关注。

3、目前乳铁蛋白肽的制备还存在着诸多问题。人乳铁蛋白肽的制备主要有乳汁中提取和基因重组两种方式。乳汁中提取产量低、工艺复杂、成本昂贵。而现有的基因重组方式是利用基因工程重组技术在微生物细胞分泌途径中表达重组人乳铁蛋白肽，产量和纯度均不高。同时，人乳铁蛋白肽单体抗菌活性和抗病毒活性较弱。

技术实现思路

1、为克服现有技术中关于重组人乳铁蛋白肽能否高效分泌表达、提高重组人乳铁蛋白肽的稳定性、现有重组人乳铁蛋白肽抗菌活性低、现有重组人乳铁蛋白肽未能规模化制备的生产的技术问题，本发明的目的在于提供一种人乳铁蛋白肽三聚体及其制备方法。具体包括人乳铁蛋白肽三聚体、编码该三聚体的多核苷酸、含有编码该三聚体的多核苷酸的重组载体、工程菌、制备该人乳铁蛋白肽三聚体的方法、该人乳铁蛋白肽三聚体的应用。

2、本发明一方面提供了一种含有重组人乳铁蛋白肽的融合蛋白，所述融合蛋白的结构用通式表示为l-c-t，其中l为重组人乳铁蛋白肽单体；c为人ⅲ型胶原蛋白c端前肽部分；t为t4 foldon蛋白，位于所述重组人乳铁蛋白肽单体的羧基末端。

3、重组人乳铁蛋白肽单体包括seq id no.1所示的氨基酸序列，或与seq id no：1具有80%以上、85%以上、90%以上、95%以上、96%以上、97%以上、98%以上、99%以上同源性的序列。

4、本发明所述的重组人乳铁蛋白肽单体的蛋白融合体,命名为hlfcin-t，蛋白融合体共108个氨基酸，其氨基酸序列如seq id no.4所示：

5、grrrsvqwcavsqpeatkcfqwqrnmrkvrgppvscikrdspiqciqacrdlkfchpelksgeywvdpnqgckldaikvfcgyipeaprdgqayvrkdgewvllstfl；此融合蛋白为基础，在分泌表达过程中形成三聚体，得到的人乳铁蛋白肽三聚体命名为3hlfcin-t。3hlfcin-t共324个氨基酸，理论分子量为37.4kda。

6、上述氨基酸序列seq id no.4中第49-81位为人ⅲ型胶原蛋白c端前肽部分，人ⅲ型胶原蛋白前肽有使胶原蛋白形成三螺旋功能，选取的多肽含二硫键可促进三聚体的形成，并使重组人乳铁蛋白肽三聚体蛋白有促进细胞增殖功效。其氨基酸序列为seq id no.2所示。

7、上述氨基酸序列seq id no.4中第82-108位为t4 foldon结构域，t4 foldon蛋白是t4噬菌体纤维蛋白的结构域，具有使融合蛋白形成三聚体的功能，其氨基酸序列为seqid no.3所示。

8、本发明还提供了一种重组人乳铁蛋白肽三聚体蛋白，所述重组人乳铁蛋白肽三聚体蛋白是重组人乳铁蛋白肽的融合蛋白通过t4 foldon三聚化模块和人ⅲ型胶原蛋白c端前肽部分形成三聚体，该三聚体蛋白具有较好的稳定性和较高抗菌活性，同时在特定浓度下还能促进细胞增殖。

9、本发明还提供了一种编码所述重组人乳铁蛋白肽融合蛋白的基因。

10、进一步的，所述编码基因包括如seq id no：5所示的核苷酸序列。

11、本发明还提供了一种含有编码上述人乳铁蛋白肽三聚体的多核苷酸的重组表达载体，所述载体包括ppic9k。

12、含有上述重组载体的重组工程菌，宿主菌为毕赤酵母、大肠杆菌、酿酒酵母、丝状真菌、芽孢杆菌等，优选的，宿主菌为毕赤酵母。

13、本发明还提供一种重组人乳铁蛋白肽三聚体的制备方法，所述方法包括：

14、（1）设计并优化所述重组人乳铁蛋白肽的编码dna序列；

15、进一步的，所述重组人乳铁蛋白肽包含所述含有重组人乳铁蛋白肽单体的蛋白融合体；

16、所述蛋白融合体的结构用通式表示为l-c-t，其中l为重组人乳铁蛋白肽单体；c为人ⅲ型胶原蛋白c端前肽部分；t为t4 foldon，位于所述重组胶原蛋白单体的羧基端。

17、进一步的，所述重组人乳铁蛋白肽单体包括seq id no：1所示的序列，或与seq idno：1具有80%以上、85%以上、90%以上、95%以上、96%以上、97%以上、98%以上、99%以上同一性的序列。

18、进一步的，所述重组人乳铁蛋白肽会通过t4 foldon和人ⅲ型胶原蛋白c端前肽部分聚集区，形成特定三聚体，所述形成重组人乳铁蛋白肽的三聚体化的融合蛋白的氨基酸序列如seq id no：4所示。

19、（2）构建表达载体：

20、将步骤（1）中所述的dna序列克隆于表达载体上，得到重组表达载体。

21、进一步的，所述表达载体包括ppic9k。

22、（3）工程菌的构建及筛选：

23、将构建好的表达载体转入毕赤酵母感受态细胞中制成工程菌，工程菌经过筛选后，接入bmgy培养基诱导表达筛选表达高的工程菌。所述筛选的表达量高的工程菌为巴斯德毕赤酵母(pichia pastoris)，命名为hlfcin3。

24、进一步的，构建的高拷贝、可高效表达外源基因的重组酵母工程菌种样本送至中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，菌种保藏编号为：cgmcc no.29181；保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号；保藏日期为：2023年11月30日。分类命名为：巴斯德毕赤酵母 komagataella phaffii。

25、（4）高密度发酵及蛋白纯化：

26、采用5l发酵罐诱导表达120h，取发酵液，检测od值、菌体湿重、上清液中蛋白含量。

27、本发明进一步的还提供了一种重组人乳铁蛋白肽三聚体的高密度发酵方法，包括如下步骤：

28、优选地，种子培养基ypg(含酵母粉10g/l、酵母蛋白胨20g/l、甘油10g/l)；发酵培养基bsm(85％h3po4 26.7ml/l、caso4·2h2o 0.93g/l、k2so4 18.2g/l、mgso4·7h2o 14.9g/l、koh 4.13g/l、甘油40.0g/l、ptm1 0.45ml/l。invitrogen公司推荐提供)；补料培养基(含50％w/v甘油，每升加12ml ptm1微量元素)；诱导培养基(含100％甲醇，每升加入12ml ptm1微量元素)；ptm1（cuso4•5h2o 6.0g/l；nai 0 .08g/l；mnso4•h2o 3.0g/l；namoo4•2h2o0.2g/l；h3bo3 0.02g/l；cocl2 0.5g/l；zncl2 20.0g/l；feso4•7h2o 65.0g/l；生物素0.2g/l；h2so4 5.0ml/l，用0.22μm的滤膜过滤除菌，4℃保存）。

29、优选地，种子液制备：工程菌接入含100ml种子培养基ypg的1l摇瓶中，220rpm、30℃，培养18-35h，至od600值。

30、5l罐装液量2l的bsm培养基，121℃高温灭菌20min。接种前调节发酵罐中转速300rpm，通气量4l/min（2vvm），温度30℃，用浓氨水调节ph，控制发酵ph=5.0。然后先接入0.9ml ptm1，然后再将制备好的od值为4的种子液按5%（v/v）接入罐内。当碳源耗尽后，溶氧突然回升至70%，开始流加补料培养基至菌体od值为220，停止补加补料培养基。甘油耗尽后开始流加诱导培养基，进入甲醇诱导培养阶段。调节转速和压缩空气通量使得溶氧大于20%，诱导培养120h测定od值、湿重和发酵上清蛋白含量。

31、对发酵上清液进行纯化，优选地，所述纯化进行阳离子层析步骤。阳离子层析采用缓冲液a平衡，缓冲液b洗脱；优选地，缓冲液a包括：20mm kh2po4，ph4.0；缓冲液b包括：20mmkh2po4，0.25m nacl,，ph4.0。

32、本发明还进一步的提供了一种重组人乳铁蛋白肽三聚体的纯化方法，包括如下步骤：

33、阳离子层析：配制缓冲液a包括：20mm kh2po4，ph4.0缓冲液b包括：20mm kh2po4，0.25m nacl,，ph4.0；用缓冲液b冲洗层析柱两个柱体积，再用缓冲液a平衡层析柱冲洗五个柱体积，然后将发酵上清液用hcl调节ph至4.0，并上样200ml/次，用缓冲液a平衡层析柱冲洗五个柱体积，使用缓冲液b进行洗脱并收集洗脱液，将洗脱液超滤冻干，得到纯化后的蛋白冻干品。

34、本发明还提供一种高纯度重组人乳铁蛋白肽三聚体在化妆品或保健品中的用途。

35、具体地，当所述重组人乳铁蛋白肽三聚体应用于化妆品时重组人乳铁蛋白肽三聚体0.01%~1%；甘油1％～5％；丙二醇1％～5％；透明质酸钠0.01％～0.1％；卡波姆0.1％～1％；甜菜碱1％～5％；β-葡聚糖0.1％～1％；霍霍巴酯0.01％～0.1％；甘草酸二钾0.1％～0.5％；虾青素0.1％～1％；其余为纯化水。

36、当所述重组人乳铁蛋白肽三聚体应用于保健品时，所述保健品各组分的质量分数为：重组人乳铁蛋白肽三聚体1%~10%；水解乳清蛋白1%~10%；甘氨酸0.1%~5%；山梨糖醇0.1%~10%；维生素c0.1%~10%；其余为纯水。

37、本发明的有益效果：

38、（1）本发明提供了一种高稳定性人乳铁蛋白肽三聚体的构建方法，通过在乳铁蛋白肽羧基端添加人ⅲ型胶原蛋白c端前肽部分和t4 foldon使得蛋白在分泌过程中形成三聚体。t4 foldon可特定形成三聚体，而人ⅲ型胶原蛋白c端前肽部分含二硫桥能进一步促进三聚体形成。该蛋白可在毕赤酵母、大肠杆菌、酿酒酵母、丝状真菌、芽孢杆菌等表达系统重表达。本发明中已经证实该人乳铁蛋白肽三聚体不但能够于毕赤酵母这种真核宿主细胞的高效分泌可溶性表达，具有较好的抗菌活性，并且可工业化生产。

39、（2）本发明涉及的重组蛋白稳定性提高，发酵和纯化过程中均不易发生降解，同时通过一步离子交换即可获得高纯度的产品，生产工艺简单，可规模化生产。

40、（3）本发明涉及的重组人乳铁蛋白肽三聚体冻干海绵经稳定性试验，有较高的稳定性。

41、（4）本发明对重组蛋白进行抑菌检测，重组人乳铁蛋白肽三聚体具有较好的抗菌活性。

42、（5）本发明对重组蛋白进行细胞增殖检测，重组人乳铁蛋白肽三聚体在特定浓度下有促进细胞增殖作用。