一种荧光原位杂交的组合物、荧光原位杂交探针试剂盒及其应用

本发明涉及生物检测领域，具体涉及一种荧光原位杂交的组合物、荧光原位杂交探针试剂盒及其应用。

背景技术：

1、芽孢杆菌通常作为几种植物作物进行研究和商业化的植物促生长细菌。评估效果的主要难点是杆菌的种类，在检测时会受到相似种类的干扰，只能通过对其16s rrna的详细分析来识别基因或仅由物种内的其他基因。例如，枯草芽孢杆菌和解淀粉芽孢杆菌两种密切相关的杆菌菌株可能是腐生的，或者是常见的植物促生长细菌，或者或两者均是。用一种植物促生长细菌定殖可能被其他物种的腐生根种类所掩盖。因此，实验室证明的成功菌株在接种失败后不能表明其作为植物促生长细菌在定殖能力方面的不足。这种遗传相关性杆菌在构建分子检测工具方面造成了重大困难，例如荧光原位杂交，现有eub338探针适用于多个杆菌种类，不能同时区分相近类别的杆菌。

技术实现思路

1、本发明的目的在于克服现有技术存在的不足之处而提供一种荧光原位杂交的组合物、荧光原位杂交探针试剂盒及其应用。

2、为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：一种荧光原位杂交的组合物，所述组合物包括杂交探针、极性非质子溶剂、羧酸酰胺、溶菌酶、硫酸葡聚糖、异硫氰酸胍、ph7.3～7.5的磷酸缓冲液、以及ssc缓冲液；

3、所述杂交探针包括杂交探针1、杂交探针2和杂交探针3，其中，杂交探针1、杂交探针2和杂交探针3的质量比例为1：(0.8～1.5)：(0.8～1.5)；

4、所述杂交探针1的序列为

5、5’-/fam/-cggcttcgctgccctttgttctgcccattgta-3’；

6、所述杂交探针2的序列为5′-/novafluor blue 610-30sdye/tac cgc cct attcga acg gta c-3′；

7、所述杂交探针3的序列为5′-/cy3/gca gcc acc cgt agg tgt-3′；

8、所述极性非质子溶剂为内酯、砜或者碳酸酯；

9、所述极性非质子溶剂、羧酸酰胺、硫酸葡聚糖的体积比为(7～25)：(10～20)：(10～20)；

10、所述溶菌酶的浓度为5～15mg/ml，所述异硫氰酸胍的浓度为0.8～1.2mol/l；

11、所述组合物中各杂交探针的浓度均为0.8～1.5μmol/l；

12、ph7.3～7.5的磷酸缓冲液的体积为极性非质子溶剂、羧酸酰胺和硫酸葡聚糖总体积的2～15倍。

13、上述荧光原位杂交的组合物通过杂交探针1、杂交探针2和杂交探针3的配合，可以同时检测区分地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、蜡样芽孢杆菌以及解淀粉芽孢杆菌，在原位杂交时地衣芽孢杆菌经原位杂交后产生绿色荧光，枯草芽孢杆菌产生橙色荧光，然杂交探针3特异性较差，由于杂交探针3的原位杂交，四种枯草芽孢杆菌均会产生红色荧光。发明人通过研究发现，配合溶菌酶对地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、蜡样芽孢杆菌以及解淀粉芽孢杆菌的处理，在特定范围浓度下溶菌酶处理地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、蜡样芽孢杆菌以及解淀粉芽孢杆菌，其中解淀粉芽孢杆菌的红色荧光点数量产生受溶菌酶处理时间的影响较大，故可以以此将解淀粉芽孢杆菌区别开来，因此上述荧光原位杂交的组合物可以同时将地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、蜡样芽孢杆菌以及解淀粉芽孢杆菌区别开来，其中，荧光显绿色、也显红色的为地衣芽孢杆菌，荧光显橙色、也显红色的为枯草芽孢杆菌，荧光不显绿色、不显橙色的，且溶菌酶分别处理15～25分钟、处理40～60分钟红色荧光点数量基本一致的为蜡样芽孢杆菌，荧光不显绿色、不显橙色的，且溶菌酶分别处理15～25分钟、处理40～60分钟红色荧光点数量变化明显，且溶菌酶处理40～60分钟红色荧光点数量是溶菌酶处理15～25分钟红色荧光点数量1.5～3倍的为解淀粉芽孢杆菌。

14、优选地，所述极性非质子溶剂为碳酸亚乙酯、碳酸乙二酯，所述羧酸酰胺为甲酰胺；

15、优选地，所述组合物还包括二硫苏糖醇、ribolock rnase抑制剂、转移核糖核酸，所述异硫氰酸胍在组合物中的浓度为0.8～1.2mol/l；二硫苏糖醇在组合物中的浓度为8～15nmol/l，ribolock rnase抑制剂在组合物中的浓度为300～500u/ml，转移核糖核酸在杂交液中的浓度为0.8～1.5mg/ml。

16、上述荧光原位杂交的组合物中，二硫苏糖醇作为巯基化dna的还原剂和去保护剂，可以降低dna的二聚化。

17、本发明还提供一种荧光原位杂交的组合物试剂盒，所述试剂盒包括杂交液、ph7.3～7.5的磷酸缓冲液、溶菌酶溶液、4％多聚甲醛以及5‰曲拉通；

18、溶菌酶溶液的浓度为8～12mg/ml，溶菌酶的溶剂为ph7.3～7.5的磷酸缓冲液；

19、所述杂交液中包括占所述杂交液体积5％～10％的ssc缓冲液、占所述杂交液体积10％～20％的甲酰胺、占所述杂交液体积7％～25％的极性非质子溶剂以及占所述杂交液体积10％～20％的硫酸葡聚糖，所述极性非质子溶剂为内酯、砜或者碳酸酯；

20、所述杂交液中还包括杂交探针、异硫氰酸胍、二硫苏糖醇、ribolock rnase抑制剂(ribolock rnase inhibitor)、转移核糖核酸(酵母trna)，所述杂交探针1的序列为5’-/fam/-cggcttcgctgccctttgttctgcccattgta-3’，所述杂交探针2的序列为5′-/novafluorblue 610-30sdye/tac cgc cct att cga acg gta c-3′，所述杂交探针3的序列为5′-/cy3/gca gcc acc cgt agg tgt-3′，各杂交探针在杂交液中的浓度为0.8～1.5μmol/l，异硫氰酸胍在杂交液中的浓度为0.8～1.2mol/l，二硫苏糖醇在杂交液中的浓度为8～15nmol/l，ribolock rnase抑制剂在杂交液中的浓度为300～500u/ml，转移核糖核酸在杂交液中的浓度为0.8～1.5mg/ml。

21、上述荧光原位杂交的试剂盒通过杂交探针1、杂交探针2和杂交探针3的配合，可以同时检测区分地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、蜡样芽孢杆菌以及解淀粉芽孢杆菌，在原位杂交时地衣芽孢杆菌经原位杂交后产生绿色荧光，枯草芽孢杆菌产生橙色荧光，然杂交探针3特异性较差，由于杂交探针3的原位杂交，四种枯草芽孢杆菌均会产生红色荧光。发明人通过研究发现，配合溶菌酶对地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、蜡样芽孢杆菌以及解淀粉芽孢杆菌的处理，在特定范围浓度下溶菌酶处理地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、蜡样芽孢杆菌以及解淀粉芽孢杆菌，其中解淀粉芽孢杆菌的红色荧光点数量产生受溶菌酶处理时间的影响较大，故可以以此将解淀粉芽孢杆菌区别开来，因此上述荧光原位杂交的组合物可以同时将地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、蜡样芽孢杆菌以及解淀粉芽孢杆菌区别开来，其中，荧光显绿色、也显红色的为地衣芽孢杆菌，荧光显橙色、也显红色的为枯草芽孢杆菌，荧光不显绿色、不显橙色的，且溶菌酶分别处理15～25分钟、处理40～60分钟红色荧光点数量基本一致的为蜡样芽孢杆菌，荧光不显绿色、不显橙色的，且溶菌酶分别处理15～25分钟、处理40～60分钟红色荧光点数量变化明显，且溶菌酶处理40～60分钟红色荧光点数量是溶菌酶处理15～25分钟红色荧光点数量1.5～3倍的为解淀粉芽孢杆菌。

22、优选地，所述极性非质子溶剂为碳酸亚乙酯或碳酸乙二酯，所述羧酸酰胺为甲酰胺。

23、本发明还提供上述任一所述荧光原位杂交的组合物在原位杂交检测地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、蜡样芽孢杆菌以及解淀粉芽孢杆菌中的应用。

24、上述荧光原位杂交的组合物能够同时将地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、蜡样芽孢杆菌以及解淀粉芽孢杆菌检测并彼此区别出来。

25、本发明还提供上述任一所述荧光原位杂交的组合物试剂盒在原位杂交检测地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、蜡样芽孢杆菌以及解淀粉芽孢杆菌中的应用。

26、上述任一所述荧光原位杂交的组合物试剂盒能够同时将地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、蜡样芽孢杆菌以及解淀粉芽孢杆菌检测并彼此区别出来。

27、本发明还提供上述任一所述荧光原位杂交的组合物试剂盒同时检测地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、蜡样芽孢杆菌以及解淀粉芽孢杆菌的原位杂交检测方法，所述方法包括以下步骤：

28、(1)将待测样品杆菌在36.5～37.5℃活化后加入ph7.3～7.5的磷酸缓冲液中形成测样品菌液；

29、(2)将定量待测样品菌液分两份滴在多聚赖氨酸涂层载玻片上，记作a样和b样，分别加入4～7倍测样品菌液体积的ph7.3～7.5的磷酸缓冲液和12～18倍测样品菌液体积的4％多聚甲醛固定0.5～1小时后用ph7.3～7.5的磷酸缓冲液洗涤；

30、(3)分别加入2～5倍体积的8～15mg/ml溶菌酶溶液分别于36.5～37.5℃下反应，a样反应15～25分钟，b样反应40～60分钟；

31、(4)分别加入0.8～1.2倍待测样品菌液体积的5‰曲拉通反应4～8分钟后用乙醇水溶液进行梯度脱水，风干；

32、(5)加入0.8～1.5倍待测样品菌液体积的杂交液后盖膜，杂交液如上述任一所述荧光原位杂交的组合物试剂盒中的杂交液，避光杂交6～12小时；

33、(6)步骤(5)杂交反应结束后用ph7.3～7.5的磷酸缓冲液洗涤后，加入0.8～1.2倍待测样品菌液体积的4',6-二脒基-2-苯基吲哚进行非特异性染色，4',6-二脒基-2-苯基吲哚的质量浓度为2.5％～3.5％，盖膜，避光染色8～15分钟后加入抗荧光催灭迹封片；

34、(7)分别通过绿光和蓝光激发，绿光参数为wg 534～558nm，蓝光参数为wb 420～485nm，探测荧光点并计数；

35、(8)根据荧光信号即荧光点数量对结果进行判定。

36、优选地，所述步骤(8)中，荧光显绿色的为地衣芽孢杆菌，荧光显橙色的为枯草芽孢杆菌，在b样中的红色荧光点数量为a样中红色荧光点数量1.5～3倍的为解淀粉芽孢杆菌。

37、上述荧光原位杂交的组合物试剂盒同时检测地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、蜡样芽孢杆菌以及解淀粉芽孢杆菌的原位杂交检测方法在原位杂交时地衣芽孢杆菌经原位杂交后产生绿色荧光，枯草芽孢杆菌产生橙色荧光，然杂交探针3特异性较差，由于杂交探针3的原位杂交，四种枯草芽孢杆菌均会产生红色荧光。发明人通过研究发现，配合溶菌酶对地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、蜡样芽孢杆菌以及解淀粉芽孢杆菌的处理，在特定范围浓度下溶菌酶处理地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、蜡样芽孢杆菌以及解淀粉芽孢杆菌，其中解淀粉芽孢杆菌的红色荧光点数量产生受溶菌酶处理时间的影响较大，故可以以此将解淀粉芽孢杆菌区别开来，因此上述荧光原位杂交的组合物可以同时将地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、蜡样芽孢杆菌以及解淀粉芽孢杆菌区别开来，其中，荧光显绿色、也显红色的为地衣芽孢杆菌，荧光显橙色、也显红色的为枯草芽孢杆菌，荧光不显绿色、不显橙色的，且溶菌酶分别处理15～25分钟、处理40～60分钟红色荧光点数量基本一致的为蜡样芽孢杆菌，荧光不显绿色、不显橙色的，且溶菌酶分别处理15～25分钟、处理40～60分钟红色荧光点数量变化明显，且溶菌酶处理40～60分钟红色荧光点数量是溶菌酶处理15～25分钟红色荧光点数量1.5～3倍的为解淀粉芽孢杆菌。

38、本发明的有益效果在于：本发明提供了一种荧光原位杂交的组合物、荧光原位杂交探针试剂盒及其应用。在原位杂交时地衣芽孢杆菌经原位杂交后产生绿色荧光，枯草芽孢杆菌产生橙色荧光，然杂交探针3特异性较差，由于杂交探针3的原位杂交，四种枯草芽孢杆菌均会产生红色荧光。发明人通过研究发现，配合溶菌酶对地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、蜡样芽孢杆菌以及解淀粉芽孢杆菌的处理，在特定范围浓度下溶菌酶处理地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、蜡样芽孢杆菌以及解淀粉芽孢杆菌，其中解淀粉芽孢杆菌的红色荧光点数量产生受溶菌酶处理时间的影响较大，故可以以此将解淀粉芽孢杆菌区别开来，因此上述荧光原位杂交的组合物可以同时将地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、蜡样芽孢杆菌以及解淀粉芽孢杆菌区别开来，其中，荧光显绿色、也显红色的为地衣芽孢杆菌，荧光显橙色、也显红色的为枯草芽孢杆菌，荧光不显绿色、不显橙色的，且溶菌酶分别处理15～25分钟、处理40～60分钟红色荧光点数量基本一致的为蜡样芽孢杆菌，荧光不显绿色、不显橙色的，且溶菌酶分别处理15～25分钟、处理40～60分钟红色荧光点数量变化明显，且溶菌酶处理40～60分钟红色荧光点数量是溶菌酶处理15～25分钟红色荧光点数量1.5～3倍的为解淀粉芽孢杆菌。