一种用于核酸杂交的组合物及其应用的制作方法

本公开涉及分子生物学领域，尤其涉及一种用于核酸杂交的组合物及其应用。

背景技术：

1、核酸测序是分子生物学中最为广泛使用的分析工具。随着测序技术的发展，其已经成为临床和生命科学研究的重要手段。然而，虽然测序技术取得了很大进步，但是由于相关的工作流程比较复杂，持续时间较长，因此仍然伴随巨大的费用和工作量。

2、为了提高效率，在测序中对某些靶标核酸序列进行富集，使得能够将测序集中在被富集的核酸序列，从而可以仅对感兴趣的靶序列进行测序，减少了成本并使得每次测序能够对更多的样品进行分析。

3、核酸杂交捕获是常用的一种核酸富集方法。目前市场上有多种杂交捕获试剂，杂交时间较长，这使得一些基于靶向捕获检测技术的临床检测手段无法在更短的时间内出结果。另外，杂交捕获清洗的过程中，涉及到过多的清洗液，操作不方便。

4、因此亟需一种体系或方法来降低工作流程的复杂性、减少杂交捕获时间，并且保证靶序列或区域的特异且均一的杂交捕获。

技术实现思路

1、为了解决现有技术中存在的至少一个技术问题，本公开提供了一种含有三价阳离子的组合物，以及所述组合物在核酸杂交捕获中的应用。应用本公开所述组合物，能够加快杂交反应进程，缩短杂交时间，并获得良好的杂交捕获效果。

2、本公开第一方面提供了一种用于核酸杂交的组合物，所述组合物包括三价阳离子盐。

3、通过采用本公开提供的组合物，可以在2小时以内的时间内完成杂交捕获，甚至可以在1个小时以内完成杂交捕获。

4、在一些实施方式中，所述三价阳离子包括但不限于，co3+、fe3+、al3+、cr3+、ni3+、b3+、ir3+、rh3+、cr3+。

5、在一些实施方式中，所述三价阳离子为络合的三价阳离子形式。

6、在一些具体实施方式中，所述络合的三价阳离子包括但不限于氨络合物[x(nh3)6]3+、联砒啶络合物[x(dpy)3]3+、乙二胺络合物[x(en)3]3+，x为三价阳离子。

7、在一些实施方式中，所述三价阳离子为氨络合的三价阳离子。

8、在一些实施方式中，所述三价阳离子为氨、乙二胺等络合的三价阳离子。

9、在一些实施方式中，所述氨络合三价阳离子包括五氨络合三价阳离子或六氨络合三价阳离子。

10、在一些实施方式中，所述氨络合三价阳离子包括三价六氨络合钴[co(nh3)6]3+、三价六氨络合铱([ir(nh3)6]3+、三价六氨络合铑[rh(nh3)6]3+、三价六氨络合铬[cr(nh3)6]3+等或其螯合物。

11、在一些具体的实施方式中，所述氨络合三价阳离子包括六氨合氯化钴。

12、在一些实施方式中，所述三价阳离子浓度为0.2～15mm。

13、在一些实施方式中，所述三价阳离子浓度选自0.2mm、0.3mm、0.4mm、0.5mm、

14、0.6mm、0.7mm、0.8mm、0.9mm、1.0mm、2.0mm、3.0mm、4.0mm、5.0mm、6.0mm、

15、7.0mm、8.0mm、9.0mm、10.0mm、11.0mm、12.0mm、13.0mm、14.0mm或15.0mm。

16、在一些实施方式中，所述三价阳离子浓度为1.0～5.0mm。

17、在一些实施方式中，所述组合物还可以包括添加剂，所述添加剂选自以下物质中的一种或多种：甘氨酸、甜菜碱、甘氨酸-甜菜碱、7-脱氮-2'-脱氧鸟苷、二甲亚砜(dmso)、聚乙二醇400～1,000,000、甘油、镁、四甲基氯化铵(tmac)、四乙基氯化铵(teac)、三乙胺盐酸盐、碳酸亚乙酯、硫酸葡聚糖、n-甲基吡咯烷酮或denhandt’s溶液。

18、在一些实施方式中，所述组合物选自甜菜碱、四甲基氯化铵(tmac)、n-甲基吡咯烷酮。

19、在一些实施方式中，所述甜菜碱的浓度选自0.5～5m。

20、在一些实施方式中，所述甜菜碱的浓度选自0.5m、0.6m、0.7m、0.8m、0.9m、1m、1.1m、1.2m、1.3m、1.4m、1.5m、1.6m、1.7m、1.8m、1.9m、2m、2.1m、2.2m、2.3m、2.4m、2.5m、2.6m、2.7m、2.8m、2.9m、3m、3.1m、3.2m、3.3m、3.4m、3.5m、3.6m、3.7m、3.8m、3.9m、4m、4.1m、4.2m、4.3m、4.4m、4.5m、4.6m、4.7m、4.8m、4.9m或5m。

21、在一些实施方式中，所述甜菜碱的浓度为1.5m。

22、在一些实施方式中，所述四甲基氯化铵的浓度选自0.5～1.5m。

23、在一些实施方式中，所述四甲基氯化铵的浓度选自0.5m、0.6m、0.7m、0.8m、0.9m、1m、1.1m、1.2m、1.3m、1.4m或1.5m。

24、在一些实施方式中，所述四甲基氯化铵的浓度为1m。

25、在一些实施方式中，所述n-甲基吡咯烷酮的浓度选自10％～20％v/v。

26、在一些实施方式中，所述n-甲基吡咯烷酮的浓度选自10％v/v、11％v/v、12％v/v、13％v/v、14％v/v、15％v/v、16％v/v、17％v/v、18％v/v、19％v/v或20％v/v。

27、在一些实施方式中，所述n-甲基吡咯烷酮的浓度为16％v/v。

28、在一些实施方式中，所述组合物还包括缓冲液。

29、在一些实施方式中，所述缓冲液，选自以下一种或多种：氯化钠柠檬酸钠缓冲液(ssc)、三(羟甲基)氨基甲烷(tris)、2-(双(2-羟乙基)氨基)乙酸)(bicine)、(n-[三(羟甲基)甲基]甘氨酸(tricine)、[三(羟甲基)甲氨基]丙磺酸(taps)、3-[n-三(羟甲基)甲氨基]-2-羟基丙磺酸(tapso)、4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸(hepes)、2-[[1,3-二羟基-2-(羟甲基)丙烷-2-基]氨基]乙磺酸(tes)、3-(n-吗啉代)丙磺酸(mops)、哌嗪-n,n’-双(2-乙磺酸)(pipes)、2-(n-吗啉代)乙磺酸(mes)、或二甲基砷酸(甲次砷酸盐)。

30、在一些实施方式中，所述缓冲液为柠檬酸钠缓冲液(ssc)。

31、在一些实施方式中，所述缓冲液的ph选自6.0～9.0。

32、在一些实施方式中，所述缓冲液的ph选自6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9或9.0。

33、在一些实施方式中，所述缓冲液的ph选自8.0。

34、在一些实施方式中，所述组合物还可以包含表面活性剂。

35、在一些实施方式中，所述表面活性剂，选自以下一种或多种：十二烷基硫酸钠(sds)、聚山梨醇酯20(20)、辛基酚乙氧基化物(tritonx-100)、辛基酚聚氧乙烯醚(ca630)、壬基酚聚氧乙烯醚(np-40)、或西曲溴铵(ctab)。

36、在一些实施方式中，所述表面活性剂为十二烷基硫酸钠(sds)。

37、在一些实施方式中，所述表面活性剂的浓度选自0.005％v/v～1％v/v。

38、在一些实施方式中，所述表面活性剂的浓度选自0.005％v/v、0.006％v/v、0.007％v/v、0.008％v/v、0.009％v/v、0.01％v/v、0.02％v/v、0.03％v/v、0.04％v/v、0.05％v/v、0.06％v/v、0.07％v/v、0.08％v/v、0.09％v/v、0.1％v/v、0.2％v/v、0.3％v/v、0.4％v/v、0.5％v/v、0.6％v/v、0.7％v/v、0.8％v/v、0.9％v/v或1％v/v。

39、在一些实施方式中，所述表面活性剂的浓度为0.1％v/v。

40、在一些实施方式中，所述组合物包括1～5mm三价钴离子，10％～20％v/v的n-甲基吡咯烷酮，0.5～5m的甜菜碱，0.5～1.5m的四甲基氯化铵和0.1v/v％的triton x-100，ph＝6.0～9.0。

41、在一些实施方式中，所述组合物包括1～5mm三价钴离子，16v/v％的n-甲基吡咯烷酮，1.5m的甜菜碱，1m的四甲基氯化铵和0.1v/v％的triton x-100，ph＝8.0。

42、根据另一方面，提供了一种核酸杂交的方法，所述方法采用了本公开的上述组合物进行核酸杂交，获得杂交产物。

43、在一些实施方式中，所述方法包括以下步骤：

44、1)在本公开的上述组合物中，混合核酸样本和核酸探针以形成混合物；

45、2)在第一温度，使所述混合物变性第一时间段；

46、3)在第二温度，温育混合物第二时间段，使核酸探针与靶核酸片段杂交获得杂交产物。

47、在一些实施方式中，所述方法还包括在杂交之前加入封闭剂，所述封闭剂与核酸样本的重复序列或接头序列互补。

48、在一些实施方式中，所述方法还包括在步骤2)之后使用第三温度保持所述混合物。

49、在一些实施方式中，所述第一温度选自94～98℃。

50、在一些具体的实施方式中，所述第一温度选自94℃、95℃、96℃、97℃或98℃。

51、在一些具体的实施方式中，所述第一温度选自95℃。

52、在一些实施方式中，所述第一时间段选自10秒钟～15分钟。

53、在一些具体的实施方式中，所述第一时间选自10秒钟、11秒钟、12秒钟、13秒钟、14秒钟、15秒钟、16秒钟、17秒钟、18秒钟、19秒钟、20秒钟、21秒钟、22秒钟、23秒钟、24秒钟、25秒钟、26秒钟、27秒钟、28秒钟、29秒钟、30秒钟、31秒钟、32秒钟、33秒钟、34秒钟、35秒钟、36秒钟、37秒钟、38秒钟、39秒钟、40秒钟、41秒钟、42秒钟、43秒钟、44秒钟、45秒钟、46秒钟、47秒钟、48秒钟、49秒钟、50秒钟、51秒钟、52秒钟、53秒钟、54秒钟、55秒钟、56秒钟、57秒钟、58秒钟、59秒钟、1分钟、2分钟、3分钟、4分钟、5分钟、6分钟、7分钟、8分钟、9分钟、10分钟、11分钟、12分钟、13分钟、14分钟或15分钟。

54、在一些具体的实施方式中，所述第一时间段选自30秒钟。

55、在一些实施方式中，所述第二温度或第三温度选自55～75℃。

56、在一些具体的实施方式中，所述第二温度或第三温度选自55℃、56℃、57℃、58℃、

57、59℃、60℃、61℃、62℃、63℃、64℃、65℃、66℃、67℃、68℃、69℃、70℃、71℃、72℃、73℃、74℃或75℃。

58、在一些实施方式中，所述第二温度或第三温度相同或不同。

59、在一些具体的实施方式中，所述第二温度或第三温度选自65℃。

60、在一些实施方式中，所述第二时间段选自30分钟～2小时。

61、在一些具体的实施方式中，所述第二时间段选自30分钟、31分钟、32分钟、33分钟、34分钟、35分钟、36分钟、37分钟、38分钟、39分钟、40分钟、41分钟、42分钟、43分钟、44分钟、45分钟、46分钟、47分钟、48分钟、49分钟、50分钟、51分钟、52分钟、53分钟、54分钟、55分钟、56分钟、57分钟、58分钟、59分钟、1小时、1.2小时、1.3小时、1.4小时、1.5小时、1.6小时、1.7小时、1.8小时、1.9小时或2小时。

62、在一些具体的实施方式中，所述第二时间段选自1小时。

63、在一些实施方式中，所述方法还可以包括，将所述杂交产物与固相载体直接或者间接连接，利用清洗液进行清洗。

64、在一些实施方式中，所述固相载体可以包括，但不限于磁性微球、塑料微球、塑胶微粒、微孔板、玻璃、毛细管和尼龙。

65、在一些具体实施方式中，所述固相载体可以为磁性微球。

66、在一些实施方式中，所述探针可以固相载体直接连接。

67、在一些实施方式中，所述直接连接包括但不限于共价键、离子键、氢键、库仑力、范德华力、疏水性相互作用。

68、在一些实施方式中，所述探针可以固相载体间接连接。

69、在一些实施方式中，所述探针可以连接有第一配体。

70、在一些实施方式中，所述固相载体可以连接有第二配体。

71、在一些实施方式中，所述第一配体和所述第二配体可以彼此配对结合。

72、在一些实施方式中，所述第一配体和所述第二配体组合可以包括但不限于，生物素-亲和素/链霉亲和素、纳米金/碘乙酰(iodacetyl)-巯基、氨基-醛基/羧基/异硫氰基、硅烷基-丙烯酰胺。

73、在一些具体的实施方式中，所述第一配体和所述第二配体可以包括生物素-链霉亲和素。在具体的实施方式中，所述第一配体可以为生物素，所述第二配体可以为链霉亲和素。

74、在一些实施方式中，所述清洗包括但不限于使用清洗液将未与固相载体结合的其他核酸分子及杂质去除，只保留与固相载体结合的杂交产物的一种或多种方式。

75、在一些实施方式中，所述清洗液为ks清洗液。

76、在一些实施方式中，所述清洗液只包括一种清洗液，所述清洗液为ks清洗液，且不包括其他清洗液。

77、在一些实施方式中，所述ks清洗液包括柠檬酸钠缓冲液ssc、十二烷基硫酸钠和/或吐温20。

78、在一些实施方式中，所述ks清洗液包括0.1～1.0×柠檬酸钠缓冲液，0.005～0.02％的十二烷基硫酸钠和/或0.005～0.02％的吐温20。

79、在一些实施方式中，所述清洗液包括0.1×、0.2×、0.3×、0.4×、0.5×、0.6×、0.7×、0.8×、0.9×或1.0×柠檬酸钠缓冲液。

80、在一些实施方式中，所述清洗液包括0.005％v/v、0.006％v/v、0.007％v/v、0.008％v/v、0.009％v/v、0.01％v/v、0.011％v/v、0.012％v/v、0.013％v/v、0.014％v/v、0.015％v/v、0.016％v/v、0.017％v/v、0.018％v/v、0.019％v/v或0.02％v/v的十二烷基硫酸钠。

81、在一些实施方式中，所述清洗液包括0.005％v/v、0.006％v/v、0.007％v/v、0.008％v/v、0.009％v/v、0.01％v/v、0.011％v/v、0.012％v/v、0.013％v/v、0.014％v/v、0.015％v/v、0.016％v/v、0.017％v/v、0.018％v/v、0.019％v/v或0.02％v/v的吐温20。

82、根据另一方面，本公开提供一种包含有所述组合物的试剂盒。

83、根据另一方面，本公开提供一种所述组合物和/或所述方法和/或所述试剂盒在核酸杂交中的应用。

84、本公开通过调整杂交反应液中离子价态来加快杂交反应进程，首次在核酸杂交体系中使用较低浓度的三价阳离子改变dna的分子状态以及杂交捕获体系中的静电势从而加快探针和变性后单链文库的复性过程，进而能够在捕获效率和均一性维持良好的条件下，缩短杂交时间，能够将捕获时间缩短至15分钟左右，而且能够将杂交反应液简化为一种，克服了三价阳离子无法用于核酸杂交反应的技术偏见，取得了预料不到的技术效果。

85、另外，将杂交洗脱中所使用的多种清洗液简化到只需要使用一种清洗液，也可获得相同的清洗效果，让操作变得更简单、易操作，进一步缩短了实验时间，简化了实验流程。