一种新型果胶特异性结合蛋白及其制备与应用

：本发明属于生物工程及其应用，具体涉及一种新型果胶特异性结合蛋白及其制备与应用。

背景技术

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背景技术：

1、果胶是一类结构复杂的天然多糖，是高等植物细胞壁的重要组成部分，与纤维素、半纤维素共同构成植物细胞初生壁和胞间层。根据其单糖组成及分子结构的差异，可分为同型半乳糖醛酸聚糖(homogalacturonan，hg)、i型鼠李半乳糖醛酸聚糖(type irhamngalacturonan，rg-i)及ii型鼠李半乳糖醛酸聚糖(type ii rhamngalacturonan，rg-ii)等类型。其复杂的结构使得其具有多样的生物活性，如免疫调节作用、抗肿瘤、降血糖、改善胃肠道等。同时，果胶也可作为天然的多功能型食品添加剂，被用作凝胶剂、乳化剂、稳定剂、增稠剂等，在食品工业、医药保健品、化工、纺织及化妆品等领域得到了广泛的应用并具有良好的发展前景。

2、碳水化合物特异性结合蛋白是碳水化合物活性酶中天然存在的底物结合模块，是组成酶的一种结构与功能独立的结构域，具有精准的多糖结合能力。糖类物质的免疫原性弱、以动物免疫制备抗体的难度大，而碳水化合物特异性结合蛋白具有分子尺寸小、获取高效、标记灵活等优势，是碳水化合物定性、定量、定位等特异性检测分析的重要工具。随着碳水化合物酶的深入研究，新型的碳水化合物特异性结合蛋白也不断被发现。发掘新型的果胶特异性结合蛋白，并选择性能优良的结合蛋白作为果胶研究与开发的新颖工具，具有实际意义。

技术实现思路

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技术实现要素：

1、本发明要解决的技术问题是碳水化合物特异性结合蛋白具有分子尺寸小、获取高效、标记灵活等优势，是碳水化合物定性、定量、定位等特异性检测分析的重要工具。而目前仍有大量存在于酶中的序列新颖、未知功能的结构域未被解析，其中也包括潜在的碳水化合物特异性结合蛋白。

2、为解决上述问题，本发明发现一段蛋白序列可以结合果胶，而不与其他碳水化合物结合，具备特异性结合的能力，并进一步的利用该特异性结合蛋白实现了果胶的检测，展现了该特异性结合蛋白的良好应用潜力。

3、为达到上述目的，本发明通过以下技术方案实现，特异性结合果胶的结合蛋白，命名为pecbp_lp，其氨基酸序列如seq id no.1所示。

4、seq id no.1：

5、atttthelnvsnsmtvgqyssdftlngftfitggsiwevdsssrsyggvnftqrvksggkgtiskraisftasgagqltvyamssgstsrnvtlygngkdlesftavqdvitamnftipnsgtyviyppddgisyyylkvvktdstptptptvkptqtptptpt

6、与把合成的蛋白质送出胞外，不参与物质结合的信号肽不同，本发明所述的果胶特异性结合蛋白pecbp_lp能够特异性结合苹果来源果胶(hg)(商业化试剂标准品，4mg/ml)、柑橘皮来源果胶(hg)、土豆来源果胶(rg-i)，而对纤维素、木聚糖、β-葡聚糖等植物中存在的其他多糖及褐藻胶、糖胺聚糖等含有糖醛酸结构的多糖均不具有结合能力(图1所示)，具备高度的特异性。本发明中的pecbp_lp制备简便、成本低，同时能够大批量获取，易用于果胶的特异性检测。

7、编码上述果胶特异性结合蛋白pecbp_lp所对应的核苷酸序列如seq id no.2所示，及可翻译出seq id no.1的所有基因。

8、seq id no.2：

9、gcaacgacgacaacacatgaattaaatgtatcaaattcaatgacagtaggacaatactcatcagattttactttaaatggatttacatttattacaggaggatctatatgggaagtagatagctctagccggtcttacggtggtgtaaactttacgcagagagttaaatcgggcggaaagggtaccattagtaaaagagcaatctcatttacagcttctggagcaggtcaattaacagtttatgcaatgagttctggaagtacttcaagaaatgtaacgctttatgggaacggtaaggatctagaaagctttactgcagtgcaagatgtcattactgctatgaattttacgattccaaattccggtacttatgttatttatccaccagacgatggtattagctactactatttaaaggtagttaaaaccgactcaacacctacaccaactccaacagtaaaaccgacccaaacacctacaccaactccaact

10、本发明提供了特异性结合果胶的结合蛋白pecbp_lp，基于pecbp_lp明确的基因序列，通过克隆表达的方法制备出特异性结合果胶的结合蛋白pecbp_lp。表达宿主为但不限于大肠杆菌、毕赤酵母、枯草芽孢杆菌等中的任意一种。包括以下及同等作用步骤：

11、(1)依据目的基因、表达载体、酶切位点设计引物，经聚合酶链式反应(pcr)得到目的基因片段pecbp_lp，pcr反应条件为95℃3min，95℃30s，52℃30s，72℃60s，循环25次。

12、(2)利用限制性内切酶双酶切目的基因及载体，连接构成重组质粒，而后将其转入感受态细胞构成重组菌株。其中，限制性内切酶和感受态细胞的选择需分别根据所选表达载体和表达宿主而定。

13、(3)菌株培养、蛋白表达及获取，该步骤所使用的条件根据不同的表达宿主而选择。

14、本发明还提供了一种基于特异性结合果胶的结合蛋白pecbp_lp对果胶进行检测的方法。基于特异性结合果胶的结合蛋白，结合微阵列技术能够实现果胶的检测。

15、对于多糖，碳水化合物活性酶的主要作用是把多糖降解，降低多糖的分子量，产生活性寡糖，在检测过程中，可以通过加酶判断有没有特征寡糖的产生，但其流程复杂，无法通过融合荧光探针实现原位分析，具有很大的局限性。结合蛋白是可以直接与多糖特异性结合，无需降解多糖，不会影响多糖分子量，能够实现原位分析。特别是糖类物质的免疫原性弱、以动物免疫制备抗体的难度大，而碳水化合物特异性结合蛋白具有分子尺寸小、获取高效、标记灵活等优势，是碳水化合物特异性检测分析的重要工具。随着碳水化合物酶的深入研究，其中的序列新颖、未知功能的结构域也不断被发现，其中也包括潜在的碳水化合物特异性结合蛋白。

16、其中第一种检测方法包括以下及同等作用步骤：

17、(1)取1μl待测样品至反应介质(硝酸纤维素膜，以下反应介质均指硝酸纤维素膜)上，室温干燥，使待测样品充分与反应介质结合。

18、(2)用含有封闭剂(脱脂奶粉)的缓冲液(磷酸盐缓冲液)封闭反应介质30-90min，避免非特异性结合干扰实验结果。

19、(3)取一定量果胶特异性结合蛋白pecbp_lp均匀滴加至反应介质上(5cm2反应介质约需2ml结合蛋白)，孵育60-120min，用水冲洗，使pecbp_lp与果胶结合。

20、(4)利用步骤(2)中缓冲液稀释(体积比1：50000-1：5000)连有辣根过氧化酶的抗组氨酸单克隆抗体，取一定量的稀释抗体(5cm2反应介质约需2ml稀释抗体)均匀滴加至反应介质上，孵育60-120min，用水冲洗。均匀滴加一定量电化学发光(ecl)试剂(5cm2反应介质约需2ml试剂)至反应介质上，显色1-2min。若pecbp_lp可以结合某种多糖，且由于pecbp_lp中含有组氨酸标签，则连有辣根过氧化酶的抗组氨酸单克隆抗体可与pecbp_lp结合进而吸附至反应介质上，而后在辣根过氧化酶的催化下，ecl试剂中的鲁米诺和过氧化氢会发生反应从而产生荧光信号。相反，由于此前利用脱脂奶粉封闭了反应介质，如果pecbp_lp对多糖没有结合能力，则连有辣根过氧化酶的抗组氨酸单克隆抗体不会结合至反应介质上，进而不会产生荧光信号。

21、(5)信号检测。若在成像仪中观察有荧光信号的出现，则代表此样品中存在果胶；若没有荧光信号，则不含有果胶。

22、其中第二种检测方法：在上述步骤(3)处还可使用荧光标记或与荧光蛋白融合表达的果胶特异性结合蛋白pecbp_lp，而后无需进行上述步骤(4)，可直接在成像仪中检测，实现样品中果胶的检测和半定量分析。

23、其中，果胶特异性结合蛋白pecbp_lp与绿色荧光蛋白gfp融合(gfp-pecbp_lp)在大肠杆菌中克隆表达及获取：

24、bamhi和nhei双酶切目的基因与prset_emgfp大肠绿色荧光表达载体，连接构成重组质粒。42℃热激处理将重组质粒转入bl21(de3)感受态细胞中构成重组菌株。利用异丙基-β-d-硫代半乳糖苷诱导表达，离心收集菌体，加入一定量20mm pbs缓冲液重悬，冰浴超声破碎，离心取上清，即可获得荧光蛋白融合表达的果胶特异性结合蛋白gfp-pecbp_lp。

25、其中对果胶进行半定量分析的方法：在上述步骤(1)处称取不同质量的果胶溶于缓冲液(磷酸盐缓冲液)中，分别取1μl具有浓度梯度的果胶标准溶液于反应介质上，室温干燥后，执行(2)-(5)步骤；信号检测后，利用图像处理软件将已知果胶浓度的荧光信号转化为灰度值，最高灰度值(即最高果胶浓度)设置为1，其它数值均相应的标准化。以灰度值为纵坐标、果胶浓度值为横坐标建立标准曲线，将待测样品的灰度值带入标准曲线即可实现对样品中果胶的半定量分析。

26、进一步的，上述缓冲液的ph值为5～10。即本发明的特异性蛋白在广泛的ph值下都适用。

27、本发明还提供了一种采用荧光标记或与荧光蛋白融合表达的特异性结合果胶的结合蛋白pecbp_lp对橘皮中的果胶进行特异性可视化观察的方法，基于荧光标记或与荧光蛋白融合表达的果胶特异性结合蛋白pecbp_lp，搭配显微镜实现果胶的特异性可视化观察。包括以下及同等作用步骤：

28、(1)将新鲜组织放入干冰中，以防止组织组成成分被破坏；

29、(2)组织通过oct包埋；

30、(3)利用切片机将组织切成厚度约为8-10μm；

31、(4)在切片上加入自发荧光淬灭剂，处理5min，超纯水冲洗；

32、(5)在切片中滴加荧光标记的pecbp_lp，孵育30min，超纯水冲洗；

33、(6)将切片置于pbs(ph 7.4)中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min；

34、(7)显微镜观察采集图像。

35、本发明的有益效果在于：

36、(1)本发明提供了一种新颖的果胶特异性结合蛋白pecbp_lp，其对多种不同来源的果胶均具有结合能力；

37、(2)本发明中的pecbp_lp制备成本低，可通过发酵规模化获取；

38、(3)本发明中的pecbp_lp序列明确，能够实现pecbp_lp的灵活标记，便于满足不同场景下的应用；

39、(4)本发明还提供了基于pecbp_lp的果胶检测方法，具有操作简便、特异性强、成本低及灵敏度高等优点；

40、(5)本发明还提供了基于pecbp_lp的可视化观察果胶的方法，具有特异性强、可用于原位分析等优点。