烟酰胺单核苷酸的制造方法与流程

本发明涉及烟酰胺单核苷酸等核酸系化合物的制造方法。

背景技术：

1、烟酰胺单核苷酸(nmn)为烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(nad+)的合成中间体。近年来，明确了nmn通过向nad+的转变来控制长寿基因“sirtuin”的活性，如果将nmn施与至小鼠则显示抗衰老作用。进一步，还报道了nmn对于糖尿病、阿尔茨海默症、心力衰竭等疾病的预防、症状的改善有效果。期待这样的nmn作为功能性食品、药品、化妆品等的成分的用途，以生产性的提高为目标，高效的制造方法的研究开发正在进行着。

2、专利文献1中记载了nmn的制造方法(权利要求1、13、15等)，其为将使烟酰胺磷酸核糖转移酶(nampt)过表达了的细胞(酵母、细菌等)分离，在烟酰胺(nam)的存在下培养该细胞。nampt是由nam和细胞内被生物合成的磷酸核糖焦磷酸(prpp)来生成nmn的酶。专利文献1中还记载了为了促进prpp的生物合成，对于上述细胞使磷酸核糖焦磷酸合成酶(prs)进一步过表达(权利要求3等)。prs为由核糖-5-磷酸(r5p)和atp来生成prpp和amp的酶。专利文献1中，在有效利用过表达特定酶的细胞的状态下，一边用含有碳源、氮源等的培养基进行培养，一边通过生物体内的酶反应来生成nmn等目标化合物。

3、专利文献2中记载了使用了相对于反应生成物的感受性被减弱(即，由于难以经受利用prs生成的prpp带来的负反馈，因此能够增加prpp向体系内的供给量)的prs突变体的nad前体合成系统(权利要求1，第0068段等)。还记载了该prs突变体可以是在重组体中生成、并且被分离、精制而得(权利要求6等)。专利文献2中还记载了系统可以进一步包含nampt、atp、r5p、prpp(权利要求10、20、21、23等)。

4、另一方面，非专利文献1中记载了使用核糖激酶(rbk，该文献中被表述为rk)、prs(同样地被表述为pps)和次黄嘌呤磷酸核糖转移酶(8b3)这三种酶，由核糖合成肌苷一磷酸(imp)的方法。rbk参与由核糖和atp生成r5p和adp的反应(i)，prs参与由r5p和atp生成prpp和amp的反应(ii)，8b3参与(iii)由prpp和肌苷酸生成imp和焦磷酸(ppi)的反应。上述非专利文献1记载的方法中，利用腺苷酸激酶由反应(ii)所生成的amp来再生adp。此外，由该被再生的adp和反应(i)所生成的adp，利用磷酸烯醇丙酮酸和丙酮酸激酶来再生atp。

5、专利文献3中记载了atp的制造方法，其为使作为单独能够由amp来合成atp的酶的多磷酸激酶(ppk)2型与多磷酸及amp发生反应。作为这样的多磷酸激酶2型，公开了来源于嗜热菌(细长嗜热聚球藻(thermosynechococcus elongatus)等)的具有特定氨基酸序列的多磷酸激酶。专利文献3中进一步还记载了在利用atp来制造物质(目标化合物)的方法中，通过同时实施上述atp的制造方法，从而使目标化合物的合成反应与atp的再生反应结合，由amp再生的atp被用于目标化合物的合成。

6、专利文献4中记载了将大肠杆菌在60～80℃进行加热，在大肠杆菌的细胞膜被破坏的状态下，进行atp的再生反应的方法，其中，大肠杆菌包含来源于即使在70℃、10分钟的热处理时也不失活的嗜热菌的ppk的基因，此外，在60～80℃时该大肠杆菌的通常的酶丧失活性并且获得多磷酸的细胞透过性。

7、专利文献5中记载了烟酰胺单核苷酸的制造方法，其为将nam、atp和核糖作为原料，在烟酰胺磷酸核糖转移酶、核糖磷酸焦磷酸激酶和核糖激酶的催化剂作用下进行反应。

8、非专利文献2中记载了利用来源于嗜热菌的ppk和利用该ppk的atp再生体系的甘油三磷酸合成方法。在该方法中，使用包含甘油、adp、多磷酸、甘油激酶(gk)、ppk等的缓冲液作为起始反应液，一边逐次添加多磷酸，一边进行反应。

9、非专利文献3中记载了谷胱甘肽的制造方法，其为使来源于血链球菌(streptococcus sanguinis)的谷胱甘肽合成酶(gshf)和由具有与专利文献3所记载的物质同样活性的来源于嗜热菌即细长嗜热聚球藻(thermosynechococcus elongates)bp-1的ppk得到的atp再生体系结合，利用级联反应进行。

10、现有技术文献

11、专利文献

12、专利文献1：国际公开2015/069860号

13、专利文献2：国际公开2016/198948号

14、专利文献3：日本特开2013-021967号

15、专利文献4：日本特开2007-143463号

16、专利文献5：国际公开2017/185549号

17、非专利文献

18、非专利文献1：scism,robert a.和bachmann,brian o.“five-component cascadesynthesis of nucleotide analogues in an engineeredself-immobilizedenzymeaggregate.”chembiochem 11.1(2010):67-70.

19、非专利文献2：restiawaty,elvi等人“feasibility ofthermophilic adenosinetriphosphate-regeneration system using thermusthermophilus polyphosphatekinase.”process biochemistry 46.9(2011):1747-1752.

20、非专利文献3：zhang,xing等人“one-pot synthesis ofglutathione by a two-enzyme cascade using a thermophilic atp regenerationsystem.”journal ofbiotechnology 241(2017):163-169.

技术实现思路

1、发明所要解决的课题

2、然而，专利文献1～5和非专利文献1～3所公开的方法在有效率地制造nmn方面存在问题，不能说是优异的方法。具体而言，专利文献1中，在有效利用过表达特定酶的细胞的状态下，一边利用含有碳源、氮源等的培养基进行培养，一边通过生物体内的酶反应来生成nmn，但其生成量为300nmol-nmn/g-酵母湿菌体重量(实施例1)。如果酵母干燥菌体重量/酵母湿菌体重量之比假定为0.2，则成为约0.5g-nmn/kg-酵母干燥菌体重量，存在生成量低这样的问题。

3、专利文献2中记载了使用了相对于反应生成物的感受性被减弱的prs突变体的nad前体合成系统。然而，没有记载显示nmn生成的实施例，没有显示具体的nmn的制造方法、生成量。

4、专利文献3中记载了将atp的制造方法与目标化合物的合成反应结合的物质制造方法，其中，atp的制造方法是使作为单独能够由amp来合成atp的酶的多磷酸激酶(ppk)2型与多磷酸及amp发生反应。然而，没有显示具体的nmn的制造方法、生成量。

5、专利文献4中记载了将包含来源于嗜热菌ppk的基因的大肠杆菌进行加热，在大肠杆菌的细胞膜被破坏的状态下，进行atp的再生反应的方法，但没有显示具体的nmn的制造方法、生成量。

6、专利文献5中记载了将烟酰胺、atp和核糖作为原料，在烟酰胺磷酸核糖转移酶、核糖磷酸焦磷酸激酶和核糖激酶的催化剂作用下进行反应的烟酰胺单核苷酸的制造方法。然而，专利文献5中，nmn的制造使用了大量的atp。具体而言，为了制造nmn而在反应体系中添加的atp的摩尔数成为生成的nmn的摩尔数的2倍以上。由于atp为昂贵的原料，因此不能说是成本上有效率的制造方法。

7、因此，迄今为止虽然示出了多种nmn的制造法，但从为了nmn的生成量和nmn的制造而言所需要的atp的量的观点考虑，这些方法都不充分。

8、本发明的课题在于提供生产效率优异的烟酰胺单核苷酸的制造方法。

9、用于解决课题的方法

10、本发明人等发现，在使nampt、prs和ppk这三种酶的表达被强化而得的转化体、表达上述三种酶而得的无细胞蛋白质合成反应液、或它们的处理物与r5p、nam、atp和多磷酸接触来进行酶反应的情况下(参照图1)，与以往的方法相比，能够有效率并且低价地生产nmn。进一步发现，在使rbk和ppk这两种酶的表达被强化而得的转化体、表达上述两种酶而得的无细胞蛋白质合成反应液、或它们的处理物与核糖、atp和多磷酸接触来制造上述r5p的情况下，能够更加有效率并且低价地生产nmn，由此完成第一发明组。

11、此外，本发明人等发现，在焦磷酸酶(ppase)的存在下，使nampt的表达被强化而得的转化体、表达上述酶而得的无细胞蛋白质合成反应液或它们的处理物与nam和prpp接触来进行酶反应的情况下，与以往的方法相比，能够有效率地生产nmn，由此完成第二发明组。

12、进一步，本发明人等发现，使转化体或它们的处理物至少与烟酰胺(nam)接触，从而能够在显著抑制nmn分解的同时有效率地生产nmn，其中，该转化体是对分类为(d)ec3.5.1.42所示的ec编号的酶进行编码的基因和对分类为以下(a)、(c)、(g)、(h)、(i)所示的任意一个以上ec编号的酶进行编码的基因被破坏或缺失、并且烟酰胺磷酸核糖转移酶(nampt)的表达被强化而得的转化体，由此完成第三发明组。

13、(a)ec 3.1.3.5

14、(c)ec 2.4.2.1

15、(g)ec 3.2.2.1

16、(h)ec 3.2.2.3

17、(i)ec 3.2.2.14

18、进一步，本发明人等发现，通过单独或多个手段的组合，能够使为了nmn的制造而在反应体系中添加的atp、adp和amp各摩尔数的总和成为生成的nmn的摩尔数的0.5当量以下，由此完成第四发明组。

19、即，本发明涉及下述[项目1]～[项目17]。

20、[项目1]

21、一种烟酰胺单核苷酸(nmn)的制造方法，其包括下述工序：使烟酰胺磷酸核糖转移酶(nampt)、磷酸核糖焦磷酸合成酶(prs)及多磷酸激酶(ppk)这三种酶的表达被强化而得的转化体、表达上述三种酶而得的无细胞蛋白质合成反应液、或它们的处理物与核糖-5-磷酸(r5p)、烟酰胺(nam)、atp及多磷酸接触。

22、[项目2]

23、根据项目1所述的nmn的制造方法，其进一步包括下述工序：使核糖激酶(rbk)及多磷酸激酶(ppk)这两种酶的表达被强化而得的转化体、表达上述两种酶而得的无细胞蛋白质合成反应液、或它们的处理物与核糖、atp及多磷酸接触来制造上述r5p。

24、[项目3]

25、根据项目1或项目2所述的nmn的制造方法，在转化体实质上不增殖的条件下进行。

26、[项目4]

27、根据项目1～3中任一项所述的nmn的制造方法，上述nampt来源于细菌。

28、[项目5]

29、根据项目1～4中任一项所述的nmn的制造方法，上述ppk为多磷酸激酶2型家族。

30、[项目6]

31、根据项目1～5中任一项所述的nmn的制造方法，上述ppk为多磷酸激酶2型家族的类别(class)3亚家族(ppk2类别3)。

32、[项目7]

33、根据项目1～6中任一项所述的nmn的制造方法，上述转化体的宿主为大肠杆菌、棒状杆菌属细菌、红球菌属细菌或酵母。

34、[项目8]

35、一种转化体，其是烟酰胺磷酸核糖转移酶(nampt)、磷酸核糖焦磷酸合成酶(prs)及多磷酸激酶(ppk)这三种酶的表达被强化而得的转化体。

36、[项目9]

37、一种转化体，其是核糖激酶(rbk)及多磷酸激酶(ppk)这两种酶的表达被强化而得的转化体。

38、[项目10]

39、一种烟酰胺单核苷酸(nmn)的制造方法，其包括下述工序：在焦磷酸酶(ppase)的存在下，使烟酰胺磷酸核糖转移酶(nampt)的表达被强化而得的转化体、表达上述酶而得的无细胞蛋白质合成反应液、或它们的处理物与烟酰胺(nam)及磷酸核糖焦磷酸(prpp)接触。

40、[项目11]

41、根据项目10所述的nmn的制造方法，在转化体实质上不增殖的条件下进行。

42、[项目12]

43、根据项目10或11所述的nmn的制造方法，上述处理物为精制酶。

44、[项目13]

45、根据项目10～12中任一项所述的nmn的制造方法，上述nampt来源于细菌。

46、[项目14]

47、一种nmn的制造方法，其包括下述工序：使转化体或它们的处理物至少与烟酰胺(nam)接触，该转化体是对分类为(d)ec 3.5.1.42所示的ec编号的酶进行编码的基因及对分类为以下(a)、(c)、(g)、(h)、(i)所示的任意一个以上ec编号的酶进行编码的基因被破坏或缺失、并且烟酰胺磷酸核糖转移酶(nampt)的表达被强化而得的转化体。

48、(a)ec 3.1.3.5

49、(c)ec 2.4.2.1

50、(g)ec 3.2.2.1

51、(h)ec 3.2.2.3

52、(i)ec 3.2.2.14

53、[项目15]

54、根据项目1～14中任一项所述的nmn的制造方法，反应体系中添加的atp、adp和amp各摩尔数的总和为生成的nmn的摩尔数的0.5当量以下。

55、[项目16]

56、一种nmn的制造方法，其是烟酰胺单核苷酸(nmn)的制造方法，包括下述工序：使烟酰胺磷酸核糖转移酶(nampt)及磷酸核糖焦磷酸合成酶(prs)这两种酶的表达被强化而得的转化体、表达上述两种酶而得的无细胞蛋白质合成反应液、或它们的处理物与核糖-5-磷酸(r5p)、烟酰胺(nam)及atp接触，反应体系中添加的atp、adp及amp各摩尔数的总和为生成的nmn的摩尔数的0.5当量以下。

57、[项目17]

58、根据项目16所述的nmn的制造方法，其进一步包括下述工序：使核糖激酶(rbk)的表达被强化而得的转化体、表达上述酶而得的无细胞蛋白质合成反应液、或它们的处理物与核糖及atp接触来制造上述r5p。

59、发明的效果

60、通过利用本发明的第一发明组的nmn的制造方法，从而与以往相比飞跃性地提高nmn的生产量(例如，成为专利文献1所记载的生产量的10倍以上)成为可能。此外，通过利用atp再生反应的本发明的制造方法，从而即使不大量地投入prpp那样的昂贵的中间体、atp，也能够将更低价的r5p或核糖作为原料来生产nmn，因此生产成本的抑制也成为可能。

61、通过利用本发明的第二发明组的nmn的制造方法，从而能够有效率地进行第3反应。由此，提高nmn的生产量、生成速度成为可能，能够抑制nmn的生产成本。

62、通过利用本发明的第三发明组的nmn的制造方法，从而在使用转化体、由转化体调制的休止菌体、膜透过性提高菌体、灭活菌体、破碎菌体、由破碎菌体调制的无细胞提取物以及对于它们进行了稳定化处理的稳定化处理物来进行nmn的生成反应时，能够抑制作为生成物的nmn的分解。由此，使用作为低价催化剂形态的菌体、无细胞提取物等，以高收率生产nmn成为可能，能够抑制nmn的生产成本。

63、通过利用本发明的第四发明组的nmn的制造方法，从而能够减少为了制造nmn而添加的atp的量。由于atp昂贵，由此，能够抑制nmn的生产成本。