一种表达突变型西罗血红素合酶的重组菌的制作方法

本发明涉及一种表达突变型西罗血红素合酶的重组菌，属于酶工程。

背景技术：

1、维生素 b12 (又称钴胺素，vb12 ) 是人体生长发育的必需营养素，是一类含有钴的咕啉类化合物总称，最早作为“抗恶性贫血因子”于1926年被发现。可以促进红细胞生长发育、叶酸的利用，或者以辅酶的形式参与催化体内的、氨基酸、脂肪酸代谢等多种重要的反应。维生素b12的分子结构极为复杂，其全化学合成需要多达70余个的反应步骤，且成本昂贵，故目前几乎都是通过微生物发酵的方式来生产维生素b12。目前工业化生产中有厌氧和好氧两种途径，最常用的菌株有：厌氧发酵的费氏丙酸杆菌（propionibacteriumfreudenreichii）和谢氏丙酸杆菌（propionibacterium shermanii）；好氧发酵的脱氮假单胞菌（pseudomonas denitrificans）。我们实验室目前使用粘着箭菌（ensifer adhaerens）来生产维生素 b12。为了较少代谢副产物对维生素 b12产量的影响，拟应用基因弱化技术来影响粘着箭菌中维生素 b12的生物合成。

2、在b12代谢通路中，西罗血红素是代谢副产物，生产菌株积累西罗血红素会相应的减少b12的积累，如果能减少西罗血红素的合成，就能有更多的原料用来合成b12。西罗血红素在生物中的主要作用是亚硝酸还原酶的辅基，会将6个电子转移到底物亚硝酸上，而cysg（西罗血红素合酶）是合成西罗血红素的必要基因，它的高酶活会使西罗血红素积累增加，从而使b12产量受限。

技术实现思路

1、本发明提供了突变型西罗血红素合酶cysg，在出发序列的基础上，具有第137位的氨基酸突变。

2、在一种实施方式中，所述突变是在seq id no.1所示出发序列的基础上，将第137位脯氨酸突变为亮氨酸，获得的突变体氨基酸序列如seq id no.3所示。

3、本发明还提供了编码所述突变体的基因。

4、在一种实施方式中，所述基因具有seq id no.4所示的核苷酸序列。

5、本发明还提供了表达所述突变型西罗血红素合酶的重组微生物细胞。

6、在一种实施方式中，所述微生物细胞为粘着箭菌（ ensifer adhaerens）。

7、在一种实施方式中，所述粘着箭菌为粘着箭菌（ ensifer adhaerens）cgmccno.23306，已公开于公开号为cn114231450a的专利申请文件中。

8、在一种实施方式中，所述重组微生物细胞以粘着箭菌cgmcc no.23306为宿主，表达seq id no.3所示的西罗血红素合酶。

9、本发明还提供了一种提高粘着箭菌维生素b12生产能力的方法，所述方法是将粘着箭菌的西罗血红素合酶氨基酸序列的第137位脯氨酸突变为亮氨酸。

10、在一种实施方式中，所述粘着箭菌为粘着箭菌cgmcc no.23306。

11、在一种实施方式中，所述西罗血红素合酶的出发序列如seq id no.1所示。

12、本发明还提供了所述突变型西罗血红素合酶和/或所述重组微生物细胞在生产维生素b12中的应用。

13、在一种实施方式中，所述应用是将所述突变型西罗血红素合酶在粘着箭菌中表达，并利用所述微生物发酵生产维生素b12。

14、本发明还提供一种生产维生素b12的方法，是将所述重组微生物细胞在发酵培养基中发酵一段时间。

15、在一种实施方式中，所述发酵是在含赤砂糖、甜菜碱、磷酸氢二铵、硫酸铵、七水硫酸锌、5,6-dmbi、六水氯化钴、三氯化铁的培养基中，于30~35℃发酵至少144小时。

16、在一种实施方式中，所述发酵是在32℃，250 rpm发酵至少144小时。

17、在一种实施方式中，用于发酵的培养基含赤砂糖、甜菜碱、磷酸氢二铵、硫酸铵、七水硫酸锌、5,6-dmbi、六水氯化钴、三氯化铁的培养基中，于30-34℃，230-270rpm条件下发酵至少144小时。

18、本发明还提供了所述重组微生物细胞或所述方法在生产维生素b12或含维生素b12的产品中的应用。

19、有益效果：

20、（1）本发明鉴定了粘着箭菌来源的西罗血红素合酶（cysg1、cysg2，分别具有seqid no.1和seq id no.2所示的氨基酸序列），并对西罗血红素合酶的氨基酸结构进行了分析，筛选出了影响西罗血红素合酶活性的关键位点，并对相关位点进行了氨基酸突变，获得了还原活性降低的西罗血红素合酶突变体p137l。

21、（2）本发明在粘着箭菌中原位表达了西罗血红素合酶突变体，使改造后的粘着箭菌vb12效价相比原始菌株提升了21.0%，具有显著的进步。

技术特征：

1.突变型西罗血红素合酶，其特征在于，在seq id no.1所示出发序列的基础上，将第137位脯氨酸突变为亮氨酸。

2.编码权利要求1所述突变体的基因。

3.表达权利要求1所述突变型西罗血红素合酶的重组微生物细胞。

4.根据权利要求3所述的表达权利要求1所述突变型西罗血红素合酶的重组微生物细胞，其特征在于，所述微生物细胞为粘着箭菌（ensifer adhaerens）。

5.根据权利要求4所述的重组微生物细胞，其特征在于，以粘着箭菌cgmcc no.23306为宿主，表达seq id no.3所示的西罗血红素合酶。

6.一种提高粘着箭菌维生素b12生产能力的方法，其特征在于，将粘着箭菌的西罗血红素合酶氨基酸序列的第137位脯氨酸突变为亮氨酸。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述粘着箭菌为粘着箭菌cgmccno.23306。

8.一种生产维生素b12的方法，其特征在于，将权利要求3~5任一所述的重组微生物细胞在发酵培养基中发酵一段时间。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述发酵是在含赤砂糖、甜菜碱、磷酸氢二铵、硫酸铵、七水硫酸锌、5,6-dmbi、六水氯化钴、三氯化铁的培养基中，于30~35℃发酵至少144小时。

10.权利要求3~5任一所述的重组微生物细胞，或权利要求6~9任一所述的方法在生产维生素b12或含维生素b12的产品中的应用。

技术总结
本发明公开了一种表达突变型西罗血红素合酶的重组菌，属于酶工程技术领域。本发明鉴定了粘着箭菌的西罗血红素合酶序列，筛选出了影响西罗血红素合酶活性的关键位点，并对相关位点进行了氨基酸突变，获得了还原活性降低的西罗血红素合酶突变体P137L。在粘着箭菌中原位表达该西罗血红素合酶突变体，可使改造后的粘着箭菌VB12效价相比原始菌株提升21.0%，具有显著的进步。

技术研发人员：高显星,章洁凝,向婷,赵德胜,陈召峰,吕国锋,李益烽,刘倩,王菊凤
受保护的技术使用者：黑龙江新和成生物科技有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/2/29