一种检测东方鲀性别决定基因AmhrII表达量的探针、引物组及检测方法和应用

本发明涉及基因检测，具体涉及一种检测东方鲀性别决定基因amhrii表达量的探针、引物组及检测方法和应用。

背景技术：

1、河鲀鱼味道鲜美，营养丰富，素有“鱼中之王”的美称。河鲀鱼在世界各地分布广泛，种类多达43种，我国查明的河鲀有35种，大部分为东方鲀属，其中常见的东方鲀属鱼类有红鳍东方鲀、暗纹东方鲀、菊黄东方鲀、双斑东方鲀等，红鳍东方鲀和暗纹东方鲀为主要养殖品种。

2、在东方鲀属中，首先在红鳍东方鲀发现其性别决定基因为amhrii基因，该基因激酶结构域单核苷酸的突变(c/g)导致单个氨基酸的改变(his384/asp384)，在xy型雄鱼表现为杂合型(amhriig/amhriic)，在xx型雌鱼表现为纯合型(amhriic/amhriic)，amhriig决定雄性分化。之后，在暗纹东方鲀和菊黄东方鲀的amhrii基因也发现同样的单核苷酸突变，暗示的amhrii基因可能也有这两种河鲀的性别决定有关。基因表达分析是揭示遗传性别决定机制的重要方法，但amhriig与amhriic只有一个碱基的差异(g/c)，传统的荧光定量pcr无法对两者序列进行准确区分并检测，转录组测序可以检测表达量，但测序成本较高，不适合大批量样品分析。因此，需要建立一种快速、低价、准确的检测红鳍东方鲀性别决定基因表达量的方法，为其性别决定机制研究提供基础。

技术实现思路

1、为建立一种快速、低价、准确的检测东方鲀性别决定基因表达量的方法，本发明提供了一种检测东方鲀性别决定基因amhrii表达量的探针、引物组及检测方法和应用，本发明提供的探针引物amhrⅱ-c和amhrⅱ-g能够准确检测东方鲀中卵巢或精巢amhrii基因的表达量，且成本低，效率高，准确率高。

2、本发明提供了一种检测东方鲀性别决定基因amhrii表达量的探针，所述探针包括序列如seq id no.1所示的amhrⅱ-c探针和序列如seq id no.2所示的amhrⅱ-g探针。

3、本发明还提供了一种包含上述检测东方鲀性别决定基因amhrii的探针的试剂盒。

4、进一步地，所述试剂盒还包括探针qpcr mix、上游引物、下游引物和ddh2o

5、进一步地，所述上游引物的核苷酸序列如seq id no.3所示，下游引物的核苷酸序列如seq id no.4所示。

6、本发明还提供了一种利用所述探针或试剂盒检测东方鲀性别决定基因amhrii表达量的方法，包括如下步骤：

7、以待测样品性腺cdna为模板，以序列如seq id no.1所示的amhrⅱ-c和序列如seqid no.2所示的amhrⅱ-g为探针引物进行qrt-pcr扩增；

8、amhrⅱ-c探针用于检测amhrⅱc基因在东方鲀卵巢和精巢中的表达量。

9、amhrⅱ-g探针用于检测amhrⅱg基因在东方鲀精巢中的表达量。

10、进一步地，amhrⅱ-g探针引物只在红鳍东方鲀精巢样品出现特异性扩增，平均ct值为23.3，根据拷贝数(x)与ct值(y)的线性方程y＝-3.358×㏒(x)+41.552；

11、amhrⅱ-c探针引物在红鳍东方鲀精巢和卵巢样品中均有扩增，平均ct值分别为26.6和24.4，根据拷贝数(x)与ct值(y)的线性方程y＝-3.571×㏒(x)+49.454。

12、进一步地，pcr体系为：2×sg探针qpcr mix 10μl，上游引物f1 0.5μl，下游引物r10.5μl，探针1μl，gdna1μl，ddh2o 7μl。

13、进一步地，所述待测样品为东方鲀性腺组织。

14、本发明还提供了一种利用所述探针或试剂盒在东方鲀性别决定基因表达量检测中的应用，所述东方鲀性别决定基因为amhrⅱc和amhrⅱg。

15、进一步地，所述东方鲀为红鳍东方鲀、暗纹东方鲀和菊黄东方鲀中的任意一种。

16、本发明还提供了所述探针或试剂盒在红鳍东方鲀性别鉴定中的应用。

17、与现有技术相比，本发明的有益效果在于：

18、1、本发明提供的amhrⅱ-g探针引物的标准曲线如图1所示，1×104copies/μl～1×1010copies/μl的浓度区间内的线性方程为y＝-3.358×㏒(x)+41.552，x表示拷贝数，y表示ct值，amhrⅱ-g标准曲线平均斜率为-3.358，p平均截距为41.552，相关系数均大于0.978，qpcr反应体系的扩增效率接近理想水平。

19、本发明提供的amhrⅱ-c探针引物的标准曲线如图2所示，在1×104copies/μl～1×1010copies/μl的浓度区间内，所得拷贝数(x)与ct值(y)的线性方程为y＝-3.571×㏒(x)+49.454。amhrⅱ-c标准曲线平均斜率为-3.571，p平均截距为49.454，相关系数均大于0.986，qpcr反应体系的扩增效率接近理想水平。

20、2、本发明提供的探针引物amhrⅱ-c和amhrⅱ-g能够准确检测不同性别红鳍东方鲀、暗纹东方鲀和菊黄东方鲀中amhrii基因的表达量，且成本低，效率高，准确率高。

技术特征：

1.一种检测东方鲀性别决定基因amhrii表达量的探针，其特征在于，所述探针包括序列如seq id no.1所示的amhrⅱ-c探针和序列如seq id no.2所示的amhrⅱ-g探针。

2.一种包含权利要求1所述探针的试剂盒。

3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括探针qpcr mix、上游引物、下游引物和ddh2o。

4.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述上游引物的核苷酸序列如seq idno.3所示，下游引物的核苷酸序列如seq id no.4所示。

5.一种利用权利要求1所述的探针或权利要求2-4任一项所述的试剂盒检测东方鲀性别决定基因amhrii表达量的方法，其特征在于，包括如下步骤：

6.根据权利要求5所述的检测东方鲀性别决定基因amhrii表达量的方法，其特征在于，amhrⅱ-g探针引物只在红鳍东方鲀精巢样品出现特异性扩增，平均ct值为23.3，根据拷贝数(x)与ct值(y)的线性方程y＝-3.358×㏒(x)+41.552；

7.根据权利要求5所述的检测东方鲀性别决定基因amhrii表达量的方法，其特征在于，pcr体系为：2×sg探针qpcr mix 10μl，上游引物f10.5μl，下游引物r1 0.5μl，探针1μl，gdna1μl，ddh2o 7μl。

8.根据权利要求5所述的检测东方鲀性别决定基因表达量的方法，其特征在于，所述待测样品为东方鲀性腺组织。

9.一种权利要求1所述的探针或权利要求2-4任一项所述的试剂盒在东方鲀性别决定基因表达量检测中的应用，其特征在于，所述东方鲀性别决定基因为amhrⅱc和amhrⅱg。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述东方鲀为红鳍东方鲀、暗纹东方鲀和菊黄东方鲀中的任意一种。

技术总结
本发明涉及基因检测技术领域，具体公开了一种检测东方鲀性别决定基因AmhrII表达量的探针、引物组及检测方法和应用，所述探针包括序列如SEQ ID NO.1所示的AmhrⅡ‑C和序列如SEQ ID NO.2所示的AmhrⅡ‑G。本发明提供的探针引物AmhrⅡ‑C和AmhrⅡ‑G能够准确检测红鳍东方鲀性别决定基因AmhrII的表达量，引物特异性强，检测成本低、效率高。

技术研发人员：胡鹏,覃川杰,吕云云,史庆超,文正勇,李燕平,李钰
受保护的技术使用者：内江师范学院
技术研发日：
技术公布日：2024/4/24