一种分子改造海参夏眠生物钟及其应用的制作方法

本发明涉及基因工程和蛋白质表达，涉及海参体内klf2和egr1基因表达降低，以及降低该蛋白量的应用研究，尤其是一种改造海参夏眠生物钟的定向改造方法。

背景技术：

1、海参作为世界八大海珍品之一，不仅是珍贵的食品，而且也是上等的名贵药材。《本草纲目拾遗》中曾记载：海参，味甘咸、补肾、益精髓、其性温补、足敌人参，故名海参。海参具有抗肿瘤、抗氧化、免疫调节、抗菌、抗病毒、降血糖及抗凝血等生物活性。随着餐饮、医药和保健品市场的快速发展，海参呈现出供不应求的市场现状。目前，海参的夏眠生物钟是影响其大量生产的主要原因，因为夏眠生物钟的存在，海参每年有四分之一的时间处于休眠状态，因此限制了其大量繁殖，影响了市场供应。

2、研究报道，可通过改变海参夏眠生物钟的状态来促进海参的生长繁殖，增加产量。如klf2和egr1基因在调控海参夏眠时发挥主要作用；夏季时，海参体内klf2和egr1基因高表达，启动海参夏眠的生物钟，使得海参进入夏眠状态。因此，此两种基因在海参体内低表达时，可改善海参的夏眠生物钟，抑制海参进入夏眠状态，使海参一直处于生长繁殖期，增加海参产量。

技术实现思路

1、本发明的目的在于克服现有技术的不足之处，克服当前海参因夏眠导致产量低的局限，提供一种提高海参产量的定向分子改造方法和经改造的海参受精卵细胞；经改造海参可在夏天时克服夏眠生物钟，一直处于生长繁殖期。与野生型海参相比，本发明定向改造海参具有克服夏眠生物钟的能力，有较大应用潜力，也为海参的大量繁殖应用奠定了理论基础。

2、本发明解决其技术问题是采取以下技术方案实现：

3、一种分子改造海参夏眠生物钟的方法，包括以下步骤：

4、s1、体外人工合成海参夏眠改造基因片段：

5、终止子-klf2，其核苷酸序列为seq id no：1，其完整的氨基酸序列为seq id no：3。

6、终止子-egr1，其核苷酸序列为seq id no：2，其完整的氨基酸序列为seq id no：4。

7、s2、通过以bca载体为模板，利用同源重组法，将体外定向合成的目标基因插入bca载体，借助大肠杆菌构建含有目标基因片段的质粒载体；

8、s3、分别将含有目标基因片段的质粒载体终止子-klf2和终止子-egr1进行线性化和纯化；

9、s4、将目标基因片段质粒载体终止子-klf2通过电转入海参受精卵细胞，并筛选和大量培养；

10、s5、将步骤s3中获得的目标基因片段质粒载体终止子-egr1通过电转入步骤s4中含有终止子-klf2的海参受精卵细胞；通过抗生素筛选并大量培养，获得经分子改造的海参受精卵细胞；

11、s6、将分子改造的海参受精卵细胞导入海参体内，经繁殖获得经分子改造的海参。

12、一种分子改造海参夏眠生物钟的应用，所述的海参夏眠改造基因片段终止子-klf2和终止子-egr1联合应用于扩大海参产量的方法中。

13、一种分子改造海参夏眠生物钟的应用，所述的海参夏眠改造基因片段终止子-klf2和终止子-egr1联合应用于扩大海参产量的生物制剂中。制剂中包括但不限于其他生物制剂所需要的配体。

14、因为经分子改造后的海参受精卵中klf2和egr1基因均携带了终止蛋白质翻译的终止序列，导致klf2和egr1序列无法翻译成蛋白质，从而降低了klf2和egr1蛋白的表达量。通过western blot方法和免疫组织应该染色法检测插入目标基因片段受精卵细胞和野生型受精卵细胞中klf2蛋白和egr1蛋白的表达量，以此来判断经过分子改造的含有目标基因的海参受精卵细胞。本研究发现经过分子改造的含有目标基因“终止子-klf2和终止子-egr1”海参受精卵细胞不表达klf2蛋白和egr1蛋白，而野生型受精卵细胞正常表达klf2蛋白和egr1蛋白，表明经分子改造的海参受精卵细胞中不表达可调控海参夏眠生物钟的klf2蛋白和egr1蛋白。

15、将经过目的基因片段分子改造海参受精卵细胞导入海参体内，繁殖获得经分子改造的海参，观察经分子改造海参在夏季时是否进入夏眠的状态；具体步骤如下：

16、1、培养分子改造的海参受精卵细胞。

17、2、通过显微注射法，将经改造的海参受精卵细胞注射入的海参体内，然后在适宜的环境下繁殖。

18、3、新生产的海参在适宜的环境中生长，在夏季时观察经分子改造后海生的生长状态，与未经改造的海参相比，经分子改造的海参是否还进入夏眠的状态。夏眠状态：海参浮于水面表面；非夏眠状态：海参在夏季时仍为水域深部生长繁殖。

19、本发明的有益效果是：

20、1、本发明提供了一种改变海参夏眠生物钟的“终止子-klf2”和“终止子-egr1”海参受精卵细胞的设计与构建方法。与野生型相比，经过分子改造的新型海参受精卵细胞不表达调控海参夏眠的klf2蛋白和egr1蛋白，经分子改造后的受精卵发育的海参不进入夏眠状态，打破了海参夏眠生物钟的局限性，为海参的大量繁殖应用奠定了理论基础。

21、2、本发明利用同源重组法构建出的改变夏眠生物钟的海参，与未经分子改造海参相比，其不进入夏眠状态，增加了海参生产的产量，具有较大的市场应用潜力以及经济价值。

技术特征：

1.一种分子改造海参夏眠生物钟的方法，其特征在于，包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的分子改造海参夏眠生物钟的方法，其特征在于，所述海参夏眠改造基因终止子-klf2的氨基酸序列如seq id no：3所示。

3.根据权利要求2所述的分子改造海参夏眠生物钟的方法，其特征在于，所述海参夏眠改造基因终止子-egr1的氨基酸序列如seq id no：4所示。

4.一种分子改造海参夏眠生物钟的应用，其特征在于，如权利要求1所述的海参夏眠改造基因片段终止子-klf2和终止子-egr1联合应用于扩大海参产量的方法中。

5.一种分子改造海参夏眠生物钟的应用，其特征在于，如权利要求1所述的海参夏眠改造基因片段终止子-klf2和终止子-egr1联合应用于扩大海参产量的生物制剂中。

技术总结
本发明提供了一种分子改造海参夏眠生物钟及其应用，属于基因工程和蛋白质表达技术领域，包括体外人工合成海参夏眠改造基因片段：终止子‑Klf2，其核苷酸序列为SEQ ID NO：1，以及终止子‑Egr1，其核苷酸序列为SEQ ID NO：2；将质粒载体终止子‑Egr1通过电转入含有终止子‑Klf2的海参受精卵细胞；获得经分子改造的海参受精卵细胞；将分子改造的海参受精卵细胞导入海参体内，经繁殖获得经分子改造的海参。终止子‑Klf2以及终止子‑Egr1在扩大海参产量的生物制剂或方法中的应用。本发明利用同源重组法构建出的改变夏眠生物钟的海参，与未经分子改造海参相比，其不进入夏眠状态，增加了海参生产的产量。

技术研发人员：李银塔,吕青桦,王旌宇,苗佳琳,韩雨晴,王福红,孙永军,鞠文明,吴丽莎,董晓静,刘荣,张玉莹,马湘君,荣爱红,孙强,杨晓华
受保护的技术使用者：山东助邦生物科技有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/3/4