基因工程菌及其构建方法和应用

本发明属于合成生物，具体涉及基因工程菌及其构建方法和应用。

背景技术：

1、植物天然产物经过长期的分子进化，以其多样独特的分子结构，不仅在宿主体内发挥着信号转导、抗逆、防御等作用，在异源表达时也具有各种的活性，是药物和食品研发的重要来源。但植物中特有的植物次生代谢产物往往含量很少，且生物合成途径并不明晰，很大程度上阻碍了这些次生代谢产物通过合成生物学的方法进行大规模的生物制造。

2、刺梨中富含的三萜类化合物具有很好的药理活性，通过解析其生物合成途径可以更好的开发和应用刺梨三萜。由于植物次级代谢产物生物合成途径的关键基因与原核生物中天然产物的合成途径不同，其关键基因簇往往离散的分布在植物染色体的不同部位，导致其遗传表达体系的建立也十分困难，这极大的阻碍了利用基因敲除和突变的传统策略进行植物次级代谢产物生物合成途径的解析。

3、目前，已在酵母中进行功能验证的大多数 p450 属于双子叶植物 cyp716 家族。大多数 cyp450 表现出混合的底物和产物，不仅作用于各种结构类似物，还氧化底物的不同位置。cyp450 的混杂催化活性有助于植物中三萜类化合物的多样化，但可能导致酵母中不理想的结构类似物。异源表达的植物 p450 在微生物中表现出较差的化学和区域选择性，限制了相关天然产物的有效生物合成。

4、因此，从自然界中获取刺梨三萜的来源很有限，而且现有技术中缺少生产刺梨酸的基因工程菌。

技术实现思路

1、本发明的目的在于，针对现有技术的上述不足，提供了基因工程菌及其构建方法和应用，通过将 rrcyp450-4与 rrcyp450-5在酿酒酵母中进行异源表达，得到能够以熊果酸为底物产生刺梨酸的菌株 dyk08。

2、为实现上述目的，本发明采用如下的技术方案：

3、本发明的第一目的是提供一种生产刺梨酸的基因工程菌，以产熊果酸和齐墩果酸的酿酒酵母为底盘菌株，将 rrcyp450-5基因和 rrcyp450-4基因依次整合至所述底盘菌株的基因组上，得到生产刺梨酸的基因工程菌，所述 rrcyp450-5基因的核苷酸序列如seq idno.1所示，所述 rrcyp450-4基因的核苷酸序列如seq id no.2所示。

4、进一步的，所述产熊果酸和齐墩果酸的酿酒酵母构建过程包括以下步骤：

5、s1、以酿酒酵母cen.pk2-1d 菌株为底盘，构建过表达ipp和dmapp的质粒载体，利用 crispr/cas9 技术将相应的基因表达盒整合至酿酒酵母cen.pk2-1d 中，得过表达 mva途径的底盘菌株，记为酿酒酵母菌株 d3；

6、s2、利用crispr/cas9 技术将 cras基因、 atcpr1基因和 crao基因整合至酿酒酵母菌株 d3 基因组中，即得到产熊果酸和齐墩果酸的酿酒酵母菌株 dyk02。

7、进一步的，步骤s1中，所述的过表达ipp和dmapp的质粒载体包括 pd1 质粒、pd2质粒和pd3 质粒，所述pd1质粒含有 thmg1、 erg10和 erg13基因表达盒，所述pd2 质粒含有 thmg1、 erg12和 idi1基因表达盒，所述pd3 质粒含有 erg20、 erg8和 mvd1基因表达盒。

8、进一步的，步骤s2中，整合的具体过程是通过将构建的pd4、pdyk01和pdyk02质粒导入到菌株 d3中；所述pd4质粒含有 cras和 erg1基因表达盒，所述pdyk01质粒含有 crao和 atcpr1基因表达盒，所述pdyk02质粒含有 phxt1基因表达盒。

9、本发明的第二目的是提供上述的基因工程菌的构建方法，包括以下具体步骤：

10、s1、以酿酒酵母dyk02 菌株为宿主，将 rrcyp450-5基因表达盒整合至 ybr128c 位点，得到菌株 dyk03；

11、s2、以菌株 dyk03为底盘菌株，将 rrcyp450-4基因表达盒整合至 dyk03酿酒酵母基因组上，得到所述基因工程菌，记为菌株 dyk08。

12、进一步的，所述 rrcyp450-5基因表达盒的质粒载体为pdyk03质粒，所述pdyk03质粒的构建过程为：以酿酒酵母 cen.pk2-1d 基因组为模板，用引物 1701-f 和1701-r，1705-f 和 1705-r，pcr 扩增整合位点同源左臂和同源右臂片段；以pdyk01质粒为模板，用引物1702-f和1702- r，pcr扩增得到gal1启动子片段；以刺梨cdna为模板，用引物1703-f和1703-r，pcr扩增得到 rrcyp450-5基因片段；以43802质粒为模板，用引物1704-f和1704-r，pcr扩增得到cyc1终止子片段；以prs426-ura质粒为模板，用引物1706-f和1706-r，pcr扩增得到质粒骨架片段；将上述片段预处理后，经酵母醋酸锂转化，组装成 pdyk03 质粒；

13、所述引物1701-f的核苷酸序列如seq id no.4所示，

14、所述引物1701-r的核苷酸序列如seq id no.5所示，

15、所述引物1702-f的核苷酸序列如seq id no.6所示，

16、所述引物1702-r的核苷酸序列如seq id no.7所示，

17、所述引物1703-f的核苷酸序列如seq id no.8所示，

18、所述引物1703-r的核苷酸序列如seq id no.9所示，

19、所述引物1704-f的核苷酸序列如seq id no.10所示，

20、所述引物1704-r的核苷酸序列如seq id no.11所示，

21、所述引物1705-f的核苷酸序列如seq id no.12所示，

22、所述引物1705-r的核苷酸序列如seq id no.13所示，

23、所述引物1706-f的核苷酸序列如seq id no.14所示，

24、所述引物1706-r的核苷酸序列如seq id no.15所示。

25、进一步的，所述 rrcyp450-4基因表达盒的质粒载体为pdyk05质粒，所述pdyk05质粒的构建过程为：以酿酒酵母 cen.pk2-1d 基因组为模板，用引物 1901-f 和1901-r，1905-f 和 1905-r，pcr 扩增整合位点同源左臂和同源右臂片段；以pdyk01质粒为模板，用引物1902-f和1902-f，pcr扩增得到gal1启动子片段；以刺梨cdna为模板，用引物1903-f和1903-r，pcr扩增得到 rrcyp450-4基因片段；以43802质粒为模板，用引物1904-f和1904-r，pcr扩增得到cyc1终止子片段；以prs426-ura质粒为模板，用引物1906-f和1906-r，pcr扩增得到质粒骨架片段；将上述片段预处理后，经酵母醋酸锂转化，组装成 pdyk05 质粒；

26、所述引物1901-f的核苷酸序列如seq id no.16所示，

27、所述引物1901-r的核苷酸序列如seq id no.17所示，

28、所述引物1902-f的核苷酸序列如seq id no.18所示，

29、所述引物1902-r的核苷酸序列如seq id no.19所示，

30、所述引物1903-f的核苷酸序列如seq id no.20所示，

31、所述引物1903-r的核苷酸序列如seq id no.21所示，

32、所述引物1904-f的核苷酸序列如seq id no.22所示，

33、所述引物1904-r的核苷酸序列如seq id no.23所示，

34、所述引物1905-f的核苷酸序列如seq id no.24所示，

35、所述引物1905-r的核苷酸序列如seq id no.25所示，

36、所述引物1906-f的核苷酸序列如seq id no.26所示，

37、所述引物1906-r的核苷酸序列如seq id no.27所示。

38、本发明的第三目的是提供上述的基因工程菌在制备刺梨酸中的应用。

39、本发明的第四目的是提供一种生产刺梨酸的方法，将上述的基因工程菌发酵培养，从培养物中获得刺梨酸。

40、进一步的，所述发酵培养过程为在ypdg 培养基中进行摇瓶发酵培养 至少120 h。

41、现有技术比较，本发明提供的技术方案带来的有益效果是：

42、（1）本发明以刺梨（ rosa roxburghii tratt.）为研究对象，对从刺梨中筛选得到的三个 rrcyp450 基因（ rrcyp450-5基因、 rrcyp450-4基因、 rrcyp450-3基因）在真核生物中的表达进行研究，首先选用基因拟南芥 atcpr1和长春花 cras、 crao构建了一株能够产熊果酸和齐墩果酸的酵母底盘菌株 dyk02，经发酵检测该菌株能够生产熊果酸的产量为3.25± 0.35 mg/l，齐墩果酸 1.78 ±1.05 mg/l；接着以菌株 dyk02 作为底盘，将 rrcyp450-4基因 与 rrcyp450-5基因在酿酒酵母菌株 dyk02中进行异源表达，最终得到一株能够产生刺梨酸的酿酒酵母菌株 dyk08，经过摇瓶发酵得到刺梨酸的产量为 104 ±2μg/l。

43、（2）本发明首次实现了刺梨酸在酿酒酵母中的全合成。