视网膜劈裂症相关的基因突变体及其应用的制作方法

本发明属于生物，特别涉及视网膜劈裂症相关的基因突变体及其应用。

背景技术：

1、视网膜劈裂症是一种x染色体连锁遗传的视网膜营养不良疾病，是造成男性青少年黄斑变性的主要原因，预估的发病率在1/5000到125000之间。该疾病通常由于神经性视网膜劈裂（裂开）导致受影响的男性视力下降，其他表现包括视网膜变性、视网膜内层分裂、视网膜电图显示b波减少等。一般情况下，女性携带者无症状，但也有受影响个体的报道，而青少年型则在10岁内表现出对称性双侧黄斑病变。视网膜劈裂症的致病基因是视网膜劈裂蛋白（retinoschisin，rs1），已被定位于染色体xp22.13，是一个编码224个氨基酸的蛋白质，该蛋白对于保持视网膜的完整性和光感受器-双极突触的功能至关重要。在临床患者的基因检测中，虽然已发现一些与视网膜劈裂症相关的rs1致病位点，但仍存在相当一部分未知的致病位点。因此，目前对视网膜劈裂症的研究还有待进一步的深入。

技术实现思路

1、为了克服上述现有技术的缺点与不足，本发明的首要目的在于提供一种视网膜劈裂症相关的基因突变体。所述基因突变体具体为rsi基因上的突变。

2、本技术通过高通量全外显子组测序联合候选突变位点的sanger验证的方案，对视网膜劈裂症患者进行了深入的研究，发现了x染色体上rs1基因的一种新的突变类型，即rs1基因nm_000330.4转录本的编码区发生c.197_199delinsa（p.g53sfs*32）的突变。

3、本发明的另一目的在于提供上述视网膜劈裂症相关的基因突变的应用。

4、本发明的目的通过下述方案实现：

5、根据本发明的第一方面，本发明提出了一种分离的编码rsi基因突变体的核酸，序列如seq id no：1所示，与野生型rs1基因相比，具有如下突变：nm_000330.4 c.197_199位碱基由ggt突变成a。即相对于野生型rs1基因，本发明的rs1基因的nm_000330.4 c.197_199位碱基发生了突变，由ggt突变成a。

6、进一步的，所述核酸的类型包括dna、rna或cdna，核酸的类型不做具体的限定，只要其与野生型rsi基因相比具有特定的突变，则应当认定其为本范围内的核酸。

7、本发明提供了一种rsi基因的新突变体，该突变体与视网膜劈裂症密切相关，从而通过检测该新突变体在生物样品中是否存在，可以有效地检测生物样品是否易患视网膜劈裂症。

8、根据本发明的第二个方面，本发明提出了一种分离的多肽，该多肽序列如seq idno：2所示，与野生型rsi基因编码的蛋白相比，具有如下突变：第53位氨基酸发生了突变，由gly突变为ser，且其长度由224aa缩短为83aa。突变型rsi基因编码的产物与野生型蛋白（或多肽，两者等同。后续解释相同）相比，第53位氨基酸发生突变，具体为第53位氨基酸由甘氨酸（gly，g）突变为丝氨酸（ser，s），同时提前出现终止密码子导致蛋白多肽链合成提前终止，原有的全长224个氨基酸也缩短为83个氨基酸。通过检测生物样品中是否表达该多肽，可以有效地检测生物样品是否易患视网膜劈裂症。本发明上述多肽是由上述核酸编码的。

9、根据本发明的第三个方面，本发明还提出了一种生物模型在筛选药物中的应用，所述生物模型至少携带上述的分离的编码rsi基因突变体的核酸和分离的多肽的至少任一。

10、所述的生物模型的一种形式为细胞模型。该细胞模型的一种应用方式为进行规模化的药物筛选，可以通过药物对细胞模型进行作用，验证该药物是否具有抑制相应突变的作用，并可据此进一步验证该药物是否可以通过抑制突变实现治疗相应的疾病，比如通过该细胞模型即可实现模拟视网膜劈裂症的疾病环境、然后进一步通过该模型实现体外验证部分药物的作用。在本条中，主要考虑的筛选因素是针对相应的突变，暂不具体限定药物的具体治疗对象，该种应用方式主要在药物研发过程中进行使用。其中，所述药物为治疗视网膜劈裂症的药物；视网膜劈裂症主要是由前述突变导致。由此，通过本生物模型实现了对一些作用效果未知的物质进行筛查，方便进一步研究该物质是否具有用于治疗视网膜劈裂症的预期。

11、根据本发明的第四个方面，本发明还提出了检测核酸和/或多肽的试剂在制备试剂盒或设备中的应用。所述的试剂盒或设备用于筛查或诊断视网膜劈裂症。其中，所述的核酸为上述的分离的编码rsi基因突变体的核酸，所述的多肽为上述的分离的多肽。

12、筛查视网膜劈裂症主要是患病风险排查，便于提前干预；诊断则是对于已经患病的人员进行辅助诊断，当然是否已经患病是以患者机体实际变化、相应的标准规范为依据，不以人的主观认知干预。

13、所述试剂包括特异性针对所述核酸和所述多肽的至少之一的抗体、探针、引物以及质谱检测试剂的至少之一。具体为试剂包括特异性检测核酸的产品，还包括特异性检测多肽的产品，该产品至少可为抗体、探针、引物以及质谱检测试剂中任一，同时还可为其他具有相似功能的试剂。另外，试剂盒的形式可为一些与现有产品类似的试剂盒，设备则可为一些序列检测设备。引物和探针均可选择其中任一，也可根据需要进行组合使用。

14、更为具体的，所述引物至少包括具有序列如seq id no：3-4所示的核苷酸序列的引物对。

15、根据本发明的第五个方面，本发明还提出了一种筛选视网膜劈裂症生物样品的试剂盒，包含有能检测rsi基因突变体的试剂；

16、所述rsi基因突变体，与野生型rs1基因相比，具有如下突变：nm_000330.4 c.197_199位碱基由ggt突变成a；或与野生型rsl基因编码的蛋白相比，具有如下突变：第53位氨基酸发生了突变，由gly突变为ser，且其长度由224aa缩短为83aa。在该种情况下，只要相应的产品应用到了能够检测前述两种rs1基因突变体中任一的试剂时，均应当视为应用了本发明的技术。

17、所述试剂包括核酸探针或引物。所述引物至少包括具有序列如seq id no：3-4所示的核苷酸序列的引物对。

18、根据本发明的第六个方面，本发明还提出了特异性改变核酸的试剂在制备药物中的用途，所述药物用于治疗视网膜劈裂症；其中，所述核酸与野生型rsl基因相比，具有如下突变：nm_000330.4 c.197_199位碱基由ggt突变成a；所述试剂至少为基于shrna、反义核酸、核酶、显性负突变、crispr-cas9、crispr-cpf1、锌指核酸酶中之一的试剂。

19、所述试剂至少为基于shrna、反义核酸、核酶、显性负突变、crispr-cas9、crisprcpf1、锌指核酸酶中之一的试剂，当然还可基于其他具有相似功能的物质。如crisprs技术是一种由rna指导cas蛋白对靶向基因进行修饰的技术，rispr-cas9主要通过基因敲除、特种变异的引入和定点转基因三种途径来实现基因组改造，基于crispr-cas9的方法，可以设计出sgrna并合成该序列的grna，然后将grna与dcas9在细胞中共表达，通过grna介导dcas9蛋白与目标dna区域结合，进而实现特定位点的修复或改变，恢复蛋白功能，相应的编辑技术均已是常规现有技术，在此不做赘述，当然所有项目的实施都必须依法施行。在本条中，主要修复的特定位点就是rsl基因的nm_000330.4 c.157_159位碱基由ggt突变成a的突变位点。

20、试剂盒也应当做宽泛的解释，还包括一些检测试纸、设备等。

21、根据本发明的第七个方面，本发明还提出了一种构建体。该构建体包含前面所述的分离的编码rsi基因突变体的核酸。需要说明的是，“构建体包含前面所述的分离的编码rsi基因突变体的核酸”表示，本发明的构建体包含有，核酸序列如seq id no：1所示，与野生型rs1基因相比，具有如下突变：nm_000330.4 c.157_159位碱基由ggt突变成a。构建体同样可以在制药过程中作为药物作用效果的检验模型。由此，利用本发明的构建体转化受体细胞获得的重组细胞，能够有效地用作视网膜劈裂症相关研究的模型。

22、根据本发明的第八个方面，本发明还提出了一种重组细胞。所述重组细胞是通过前述的构建体转化受体细胞而获得的。根据本发明的实施例，本发明的重组细胞能够有效地用作视网膜劈裂症相关研究的细胞模型，用于科学研究或商业化药物研究，如药物筛选或rsl基因的致病机理研究。

23、对于本发明中所述核酸，本领域技术人员应当理解，实际包括互补双链的任意一条，或者两条。为了方便，在本发明中，虽然多数情况下只给出了一条链，但实际上也公开了与之互补的另一条链。例如，提及seq id no:1，实际包括其互补序列。本领域技术人员还可以理解，利用一条链可以检测另一条链，反之亦然。

24、本发明相对于现有技术，具有如下的优点及有益效果：

25、本发明提供了一种用于诊断视网膜劈裂症的基因突变体，为现有的基因领域提供了新的突变型基因，并进一步研究了该突变基因的应用。确定了本发明涉及的突变与视网膜劈裂症的联系，并据此为视网膜劈裂症的诊疗提供新的方案，尤其是为视网膜劈裂症提供了诊断治疗的手段。