p-Tau217特异性抗体及其在阿尔茨海默症辅助诊断试剂盒的应用的制作方法

本技术属于免疫分析，涉及一种靶向p-tau 217的抗体、检测p-tau 217的试剂盒及其在阿尔茨海默症辅助诊断的应用。

背景技术：

1、阿尔茨海默症(alzheimer’s disease，ad)是一种年龄相关的、进行性和不可逆的神经退行性疾病，常发病于老年阶段或老年前期。临床表现为在没有意识障碍的状态下，记忆、思维、分析判断、空间辨认、情绪、日常生活能力进行性减退并有各种神经精神症状和行为障碍。根据认知程度受损的严重程度，分为轻度、中度和重度。轻度ad患者虽然开始忘记熟悉的单词或物体的位置，但生活仍然可以自理，发展到中度，患者变得更健忘，更难以完成日常任务，并经历性格和行为的变化，重度ad患者则不能再对他们的环境做出反应，不能进行交谈，也不能控制运动或控制大便。

2、研究发现，ad的主要病理表现有脑内细胞外的老年斑(senile plaques)沉积、细胞内的神经原纤维缠结(neurofibrillary tangles，nft)以及胆碱功能缺损等，最终造成神经元损伤和坏死并最终导致海绵脑病。其中，由β淀粉样蛋白组成的老年斑以及由磷酸化tau蛋白（phosphorylated tau，p-tau）组成的胞内神经原纤维缠结是ad主要神经病理学特征。目前已经有多种发病机制试图解释这些改变，包括aβ淀粉样蛋白级联假说、tau蛋白假说、炎症假说以及其他机制如神经血管受损学说、氧化应激和线粒体功能障碍等。

3、tau蛋白假说认为：tau蛋白过度磷酸化导致正常的tau蛋白和其他微管相关蛋白含量下降，从而导致微管分解并损害轴突运输功能。同时，过度磷酸化的tau蛋白容易聚集成不溶性的纤维并聚集成更大的纤维缠结。最后微管稳定性的丧失和神经纤维缠结的形成损害了神经元和突触功能。迄今为止，人们发现涉及tau蛋白异常磷酸化修饰的位点大约有84个，占 tau 全部氨基酸数目的20%，在酪氨酸、丝氨酸和苏氨酸上分别有4个、45个和35个磷酸化位点，容易发生磷酸化修饰的位点有 pt181、ps200、pt217、pt231、ps396、ps400 和ps404 等。

4、目前，tau磷酸化位点的检测方法包括液相色谱-质谱联用（liquidchromatograph-mass spectrometry，lc-ms）、碳纳米管传感器（carbon nanotubes senor，cnts senor）和一些基于抗原抗体结合的方法，如酶联免疫吸附测定（enzyme-linkedimmunosorbent assay，elisa）、免疫印迹（western blot）、斑点印迹（dot blot）等。市面上只有极少数厂家开发出检测p-tau 217蛋白的试剂盒，需要配合特异性识别p-tau 217的单克隆抗体。但市面上此类单抗的数量少、灵敏度低、特异性差，给相关的检测带来了一定的障碍，有必要开发一种识别人p-tau 217蛋白的抗体来解决上述问题。

技术实现思路

1、本技术的目的在于克服现有技术的不足，为了对tau蛋白第217位苏氨酸是否发生了磷酸化进行高特异性、高灵敏度检测，本技术提供一种识别tau蛋白pt217磷酸化的单克隆抗体及其在化学发光免疫检测试剂盒中的应用，为与p-tau 217相关的疾病的辅助诊断提供工具，更进一步地提供该抗体或试剂盒在辅助诊断阿尔茨海默症中的应用。

2、一方面，本技术提供一种特异性结合p-tau 217的抗体或其抗原结合片段。

3、在一些实施方案中，所述抗体或抗原结合片段包含至少一种、两种、三种、四种、五种或六种选自下述的cdr： (a)包含与seq id no：1的氨基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的cdr-h1；(b)包含与seq id no：2的氨基酸序列的具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的cdr-h2；(c)包含与seq id no：3的氨基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的的cdr-h3；(d)包含与seq id no：4的氨基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的的cdr-l1；(e)包含与sts的氨基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的的cdr-l2；和(f)包含与seq id no：5的氨基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的的cdr-l3。

4、在一些实施方案中，所述抗体或抗原结合片段包含至少一种、至少两种或所有三种选自下述的vh cdr序列： (a)包含与seq id no：1的氨基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的的cdr-h1；(b)包含与seq id no：2的氨基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的的cdr-h2；和(c)包含与seq id no：3的氨基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的的cdr-h3。在一些实施方案中，所述抗体或抗原结合片段包含(a)包含seq id no：1的氨基酸序列的cdr-h1；(b)包含seq id no：2的氨基酸序列的cdr-h2；和(c)包含seq id no：3的氨基酸序列的cdr-h3。

5、在一些实施方案中，所述抗体或抗原结合片段包含至少一种、至少两种或所有三种选自下述的vl cdr序列： (a)包含与seq id no：4的氨基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的的cdr-l1；(b)包含与sts的氨基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的的cdr-l2；和(c)包含与seq id no：5的氨基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的的cdr-l3。在一些实施方案中, 该抗体或抗原结合片段包含(a)包含与seq id no：4的氨基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的的cdr-l1；(b)包含与sts的氨基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的的cdr-l2；和(c)包含与seq id no：5的氨基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的的cdr-l3。

6、在一些实施方案中，所述抗体或抗原结合片段包含(a)包含至少一种、至少两种或所有三种选自下述的vh cdr序列的vh域： (i)包含与seq id no：1的氨基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的的cdr-h1；(ii)包含与seq id no：2的氨基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的的cdr-h2；(iii)包含与seq id no：3的具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的氨基酸序列的cdr-h3；和(b)包含至少一种、至少两种或所有三种选自下述的vl cdr序列的vl域：(i)包含与seq id no：4的氨基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的的cdr-l1；(ii)包含与sts的氨基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的的cdr-l2；和(c)包含与seq id no：5的氨基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的的cdr-l3。

7、在一些实施方案中，所述抗体或抗原结合片段包含(a)包含seq id no：1的氨基酸序列的cdr-h1；(b)包含seq id no：2的氨基酸序列的cdr-h2；(c)包含seq id no：3的氨基酸序列的cdr-h3；(d)包含seq id no：4的氨基酸序列的cdr-l1；(e)包含sts的氨基酸序列的cdr-l2；和(f)包含选自seq id no：5的氨基酸序列的cdr-l3。

8、在一些实施方案中，所述抗体或抗原结合片段包含与seq id no：6的氨基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的重链可变域(vh)序列。在一些实施方案中, 具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%同一性的vh序列相对于参照序列含有替代(例如保守替代)，插入，或删除，但是包含该序列的抗p-tau 217抗体保留结合p-tau 217的能力。在一个实施方案中，该vh包含一种、两种或三种选自下述的cdr： (a)包含seq id no：1的氨基酸序列的cdr-h1；(b)包含seq id no：2的氨基酸序列的cdr-h2；和(c)包含seq id no：3的氨基酸序列的cdr-h3。

9、在一些实施方案中，所述抗体或抗原结合片段包含与seq id no：7的氨基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的轻链可变域(vl)。在一些实施方案中，具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的vl序列相对于参照序列含有替代(例如保守替代)、插入、或删除，但是包含该序列的抗p-tau 217抗体保留结合p-tau 217的能力。在一些实施方案中，该vl包含一种、两种或三种选自下述的cdr： (a)包含seq id no：4的氨基酸序列的cdr-l1；(b)包含sts的氨基酸序列的cdr-l2；和(c)包含seq id no：5的氨基酸序列的cdr-l3。

10、在一些实施方案中，所述抗体或抗原结合片段包含如任何上文提供的实施方案中的vh，和如任何上文提供的实施方案中的vl。在一些实施方案中，该抗体包含分别在seq idno：6和seq id no：7中的vh和vl序列，包括那些序列的翻译后修饰。

11、一方面，本技术提供一种多核苷酸，其编码本技术的抗体或抗原结合片段。

12、一方面，本技术提供一种载体，其包含本技术的多核苷酸。

13、在一些实施方案中，提供一种编码本文所描述的抗p-tau 217抗体的分离的核酸。此类核酸可编码包含抗体的vl的氨基酸序列和/或包含抗体的vh的氨基酸序列(例如抗体的轻链和/或重链)。在一些实施方案中，提供一或多种包含此类核酸的载体(例如表达载体)。

14、一方面，本技术提供一种宿主细胞，其包含本技术的多核苷酸或载体。

15、在一个此类实施方案中，宿主细胞包含：(1)包含编码包含抗体vl的氨基酸序列和包含抗体vh的氨基酸序列的核酸的载体；或(2)包含编码包含抗体vl的氨基酸序列的核酸的第一载体和包含编码包含抗体vh的氨基酸序列的核酸的第二载体。在一些实施方案中，宿主细胞是真核细胞，宿主细胞是293细胞。在一些实施方案中，提供一种制造抗tau抗体的方法，其中所述方法包括在适合于表达抗体的条件下培养如上文所提供的包含编码所述抗体的核酸的宿主细胞，和任选地从所述宿主细胞(或宿主细胞培养基)回收所述抗体。

16、一方面，本技术提供一种检测tau蛋白磷酸化试剂盒。

17、在一些实施方案中，所述试剂盒包含本技术的抗体或抗原结合片段。在一些实施方案中，所述试剂盒以非诊断目的免疫检测p-tau 217。在一些实施方案中，所述试剂盒为化学发光法、电化学发光法、elisa。在一些实施方案中，所述试剂盒是双抗夹心原理的化学发光免疫检测试剂盒，其包括：靶向p-tau 217的第一抗体包被的磁珠；经化学发光剂标记的靶向p-tau 217的第二抗体。在一些实施方案中，所述化学发光剂选自吖啶酯、碱性磷酸酶(alp)、辣根过氧化物酶(hrp)中的至少一种。

18、在一些实施方案中，所述靶向p-tau 217的第一抗体和第二抗体组成的抗体对中的一个抗体选自如上所述的抗体或抗原结合片段。在一些实施方案中，所述靶向p-tau 217的第一抗体和第二抗体组成的抗体对中的另一个抗体的重链cdrh1-cdrh3氨基酸序列如seq id no：18-seq id no：20所示，轻链cdrl1的氨基酸序列如seq id no：21所示，轻链cdrl2的氨基酸序列为ras，轻链cdrl3的氨基酸序列为如seq id no：22所示。在一些实施方案中，所述靶向p-tau 217的第一抗体和第二抗体组成的抗体对中的另一个抗体的包含如seq id no：16所示的重链可变区vh和如seq id no：17所示的轻链可变区vl。

19、在一些实施方案中，所述第二抗体为本技术所述的抗体或抗原结合片段，所述第一抗体的重链cdrh1-cdrh3氨基酸序列如seq id no：18-seq id no：20所示，轻链cdrl1的氨基酸序列如seq id no：21所示，轻链cdrl2的氨基酸序列为ras，轻链cdrl3的氨基酸序列如seq id no：22所示。在一些实施方案中，所述所述第二抗体为本技术所述的抗体或抗原结合片段，所述第一抗体包含如seq id no：16所示的重链可变区vh和如seq id no：17所示的轻链可变区vl。

20、一方面，本技术提供了如上述的抗体或抗原结合片段在制备用于检测p-tau 217的试剂或试剂盒中的应用。

21、一方面，本技术提供了如上述的抗体或抗原结合片段或如上述的试剂盒在辅助诊断阿尔茨海默症的应用。

22、一方面，本技术提供了如上述的抗体或抗原结合片段的制备方法，具体采用单b细胞抗体克隆技术制备，包括以下步骤：

23、(1)使用p-tau 217为免疫原免疫兔，免疫结束后收集脾脏并分离脾细胞；

24、(2)筛选特异性b淋巴细胞，并提取其总rna，合成cdna，再利用pcr获得抗体可变区及恒定区序列；

25、(3)将扩增的抗体基因插入重组表达载体中，转染293细胞；

26、(4)收集培养上清并纯化，即得单克隆抗体。

27、进一步地，步骤1)所述p-tau 217的氨基酸序列如seq id no：8所示。

28、进一步地，步骤2)所述pcr所用的引物序列如seq id no：9-11所示。

29、抗体重链编码区基因扩增，正向引物序列为：

30、caagctggctagcgtttaaacttgccaccagtcgtatgaagctaagagatc(seq id no：9)。

31、抗体重链编码区基因扩增，反向引物序列为：

32、tagtggatccgagctcggtacctcatttacccggagagcg(seq id no：10)。

33、抗体轻链编码区基因扩增，正向引物序列为：

34、caagctggctagcgtttaaacttgccaccagtcgtatgaagctaagagatc(seq id no：9)。

35、抗体轻链编码区基因扩增，反向引物序列为：

36、tagtggatccgagctcggtacctcaacagtcacccctattg(seq id no：11)。

37、进一步地，步骤4)所述纯化具体为：上清过proteina亲和层析柱进行纯化。

38、一方面，本技术提供了一种特异性结合p-tau 217的抗体或抗原结合片段的配对筛选方法，具体采用固定重链可变区如seq id no：16所示和轻链可变区如seq id no：17所示的抗体rabbit-anti-tau-mab-a，通过夹心elisa实验配对筛选抗体或抗原结合片段。

39、本技术的有益效果

40、本技术提供了一种新的靶向p-tau 217的重组抗体及包含上述重组抗体的试剂盒，本技术的重组抗体亲和力高、灵敏度高、生产周期明显缩短，更适合作为核心原料应用于体外诊断试剂领域。