一种通过酶降解胞外物质并提高黏细菌转染率的方法

本发明属于微生物学和分子生物学领域，具体涉及一种通过酶降解胞外物质并提高黏细菌转染率的方法。

背景技术：

1、黏细菌是自然界中广泛存在的一类革兰氏阴性杆菌，基于目前的分类标准，黏细菌被归类为黏细菌门。黏细菌具有复杂的社会学行为和生活史，是研究细菌多细胞群体行为的重要材料。黏细菌是一类捕食性细菌，其依赖于“狼群性捕食”的捕食策略，细胞聚集起来分泌大量的裂解酶，杀死周围黏附的细菌、真菌等细胞，吸收其养分，黏细菌这一特点可以被用来治理病原菌引起的农业病害。除此之外，黏细菌能够产生多种具有生物活性的次级代谢产物，是继放线菌之后又一重要药源微生物，其次级代谢产物的多样性和新颖性使其在生物医学和环境保护方面具有极大的应用价值。

2、黏细菌的开发和利用依赖于遗传操作技术的进步，但由于黏细菌生长缓慢、胞外物质丰富等特点，其遗传操作技术的开发十分受限。目前，电转化和接合转移是黏细菌中应用较多的遗传操作技术，其中电转化应用最为广泛。模式菌的遗产操作技术较为成熟和完善，但仍有极大部分的非模式黏细菌无法进行遗传操作。

3、黏细菌遗传操作困难的原因之一就是细胞表面普遍且大量存在的胞外多糖(eps)。有研究表明，模式黏细菌黄色黏球菌胞外多糖组成成分包括半乳糖、氨基葡萄糖、葡萄糖等。黏细菌的胞外多糖不仅使其容易在液体培养时细胞聚集成团，影响质粒转化；而且其与edna形成的高度组织化的丝网状结构，进一步阻碍外源质粒进入细胞。因此，急需找到降解胞外多糖使细胞分散，从而提高黏细菌电转化效率的方法。

技术实现思路

1、为了解决上述问题，本发明提供一种通过酶降解胞外物质并提高黏细菌转染率的方法。本发明通过向细胞培养液中添加葡萄糖苷水解酶，降解胞外多糖，从而使液体培养时聚团的细胞分散，提高黏细菌菌株的电转化效率。

2、为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

3、本发明的第一个方面，提供了一种通过酶降解胞外物质并提高黏细菌转染率的方法，包括：

4、将黏细菌菌株活化到固体培养基，将长出来的菌株细胞先接种到ctt液体培养基进行培养，再转接到新鲜的ctt液体培养基进行培养，得到菌液；

5、采用糖苷水解酶对所述菌液进行处理，糖苷水解酶终浓度为0.1-40u/ml，将酶处理后的菌液离心，收集菌体，制成菌悬液；

6、将所述菌悬液与质粒混合后，进行电转化，即得。

7、在一些实施方式中，所述糖苷水解酶为α-葡萄糖苷酶、β-葡萄糖苷酶或β-葡聚糖酶。

8、在一些实施方式中，所述糖苷水解酶终浓度分别是α-葡萄糖苷酶：0.9-1.1u/ml，β-葡萄糖苷酶：0.09-0.11u/ml，β-葡聚糖酶：36-44u/ml。

9、在一些实施方式中，采用糖苷水解酶对菌液进行处理的温度为28-32℃。

10、在一些实施方式中，采用糖苷水解酶对菌液进行处理的时间为1-1.2h。

11、在一些实施方式中，菌株活化后接种于ctt培养基中培养2-3天后，再转接到新鲜的ctt培养基中培养24-32h。

12、在一些实施方式中，所述质粒为pzjy4111、pbj113或pminihimar。

13、在一些实施方式中，所述菌株是大孢珊瑚球菌(corallococcus macrosporus)，可采用市售黏细菌。

14、本发明还提供了糖苷水解酶在使聚团细胞分散并提高黏细菌电转化效率中的应用，所述糖苷水解酶为α-葡萄糖苷酶、β-葡萄糖苷酶或β-葡聚糖酶。

15、在一些实施方式中，质粒为pbj113，所述糖苷水解酶为β-葡萄糖苷酶；

16、在一些实施方式中，质粒为pminihimar，所述糖苷水解酶为α-葡萄糖苷酶或β-葡聚糖酶。

17、本发明的有益效果

18、(1)本发明在黏细菌液体培养一段时间后添加糖苷水解酶，可以有效降解胞外多糖，使细胞不易聚集黏附，从而可以分散生长；糖苷水解酶还可以从一定程度上破坏胞外多糖和edna形成的丝网状结构。

19、(2)本发明中，黏细菌菌株经过糖苷水解酶预处理后，常规方式下无法转化的质粒可以成功转化到细胞中。

20、(3)本发明针对黏细菌胞外多糖含量高、易聚团生长的特点，开发了一种使聚团细胞分散并提高质粒转化效率的方法，为深入研究黏细菌提供了技术支持。

技术特征：

1.一种通过酶降解胞外物质并提高黏细菌转染率的方法，其特征在于，包括：

2.如权利要求1所述的通过酶降解胞外物质并提高黏细菌转染率的方法，其特征在于，所述糖苷水解酶为α-葡萄糖苷酶、β-葡萄糖苷酶或β-葡聚糖酶。

3.如权利要求1所述的通过酶降解胞外物质并提高黏细菌转染率的方法，其特征在于，所述糖苷水解酶终浓度分别是α-葡萄糖苷酶：0.9-1.1u/ml，β-葡萄糖苷酶：0.09-0.11u/ml，β-葡聚糖酶：36-44u/ml。

4.如权利要求1所述的通过酶降解胞外物质并提高黏细菌转染率的方法，其特征在于，采用糖苷水解酶对菌液进行处理的温度为28-32℃。

5.如权利要求1所述的通过酶降解胞外物质并提高黏细菌转染率的方法，其特征在于，采用糖苷水解酶对菌液进行处理的时间为1-1.2h。

6.如权利要求1所述的通过酶降解胞外物质并提高黏细菌转染率的方法，其特征在于，菌株活化后接种于ctt培养基中培养2-3天后，再转接到新鲜的ctt培养基中培养24-32h。

7.如权利要求1所述的通过酶降解胞外物质并提高黏细菌转染率的方法，其特征在于，所述质粒为pzjy4111、pbj113或pminihimar。

8.如权利要求1所述的通过酶降解胞外物质并提高黏细菌转染率的方法，其特征在于，所述菌株是大孢珊瑚球菌(corallococcus macrosporus)。

9.糖苷水解酶在使聚团细胞分散并提高黏细菌电转化效率中的应用，其特征在于，所述糖苷水解酶为α-葡萄糖苷酶、β-葡萄糖苷酶或β-葡聚糖酶。

10.如权利要求9所述的糖苷水解酶在使聚团细胞分散并提高黏细菌电转化效率中的应用，其特征在于，若质粒为pbj113，所述糖苷水解酶为β-葡萄糖苷酶；

技术总结
本发明提供了一种通过酶降解胞外物质并提高黏细菌转染率的方法，属于微生物学和分子生物学领域，黏细菌活化后接种于CTT液体培养基中，培养一段之间后，添加适量的糖苷水解酶处理一段时间，离心收集菌体，然后用预冷的无菌去离子水洗涤多次，重悬于适量预冷的无菌去离子水中，与一定量的质粒混合后进行电转化。实验证实，经过糖苷水解酶处理后，黏细菌胞外多糖含量明显减少，液体培养时分散细胞数量增多，质粒更容易转化到细胞中。本发明针对黏细菌液体培养时易聚团的特点，开发了一种简便、低成本的电转化方法，为深入研究黏细菌提供了一种有效途径。

技术研发人员：李越中,卓丽,马寒
受保护的技术使用者：山东大学
技术研发日：
技术公布日：2024/4/29