一种纳豆激酶活性平板及其使用方法

本发明涉及生物检测，尤其涉及一种纳豆激酶活性平板及其使用方法。

背景技术：

1、纤溶酶是指能专一降解纤维蛋白凝胶的蛋白水解酶，是人体和动物体内纤溶系统中的一个重要组份，是防止形成血栓的重要影响因子。纳豆芽孢杆菌分泌的纳豆激酶也属于纤溶酶，由于其半衰期长、无出血倾向、安全可靠等优点，所以高纳豆激酶活性的发酵产品引起了健康需求人群的关注，市场前景发展较好。

2、纳豆激酶活性是纳豆芽孢杆菌发酵产物的重要指标之一，纳豆激酶活性的检测方法包括甲基苯黄酰-l-精氨酸甲酯底物显色法(tame，也称四肽底物法)、小肽产物的紫外分光度法、纤维蛋白块溶解时间法(clt法，同中国药典中尿激酶检测的气泡法)、纤维蛋白平板法和酪蛋白平板法等；其中的tame法和小肽产物法的原理与其纤溶酶的专属对应性差；clt法由于操作要求高，测量区间小；纤维平板法和酪蛋白平板法均是基于蛋白的溶解，形成透明圈，其面积与酶活有正相关性。其中的纤维平板法采用纤维蛋白原和凝血酶，在琼脂糖为支架结构下，形成人造血栓，其透明圈面积与纳豆激酶的纤溶活性相关性契合。其操作过程相对简易可行，实验条件只要求提供恒温控制，结果的测量简单，所以常用于纳豆激酶、蚓激酶和尿激酶等的纤溶活性测定，而酪蛋白可以认为是简易版的纤维平板法，但是专属性稍差。

3、用于纳豆激酶等纤溶酶测定的纤维平板法所用试剂为牛纤维蛋白原和凝血酶，在一定温度下溶解后，均匀与琼脂糖介质混合，铺到玻璃平皿中，待凝固后即为人工血液纤维蛋白平板，在平板上滴加纤溶酶溶液，37℃温度培养15-18h，取出测量透明圈的面积，以尿激酶为标准，画出对应曲线，带入样品的透明圈面积，即得样品的纤溶酶活性，但是现有的平板和检测方法的存在以下缺点：1.牛纤维蛋白原试剂价格较高；2.平皿由于底部不平，所铺平板的厚度有差异，不同平皿之间差异更大；3.平皿是圆形，在其上点样品面积边缘狭窄，测试样品数量少，造成整体检测效率低，成本高。

技术实现思路

1、本发明所要解决的技术问题，是针对上述存在的技术不足，提供了一种纳豆激酶活性平板及其使用方法，可以一板多样本测试，降低试剂的用量和成本，并且有效提高纤溶酶活性的测定精准度，适用性广。

2、为解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案是，包括：底板、盖板和塑料盒；所述底板和盖板的一侧边缘处对齐，并设有方向向上的预留缺口，且所述底板和盖板呈倾斜状态放置在塑料盒中。

3、一种纳豆激酶活性平板的使用方法，包括以下步骤：

4、s1、制备试剂溶液，所述试剂溶液包括缓冲液、琼脂糖、尿激酶标准液、牛纤维蛋白原液和凝血酶溶液；

5、s2、将所述琼脂糖加热融化，与牛纤维蛋白原液、凝血酶溶液放在55℃水浴中，混合均匀后，从所述盖板与底板的预留缺口部分注入，常温放置，待凝固后，放平，在超净台内取下盖板，静置备用；

6、s3、纤维平板放到超净台内，待表面水分略干，将平板底部白纸画线，标记样本或标品名称，用移液枪分别取10μl滴到方格中心位置，干燥后，放到恒温箱内，37℃孵育15h；

7、s4、取出平板，用游标卡尺测量透明圈的直径，以尿激酶的活性的对数为纵坐标，以透明圈的面积值为横坐标，得到酶活与透明圈面积的方程式，然后将待测样本的透明圈面积代入该方程，即得到样本的酶活。

8、优选的，所述缓冲液为0.2mol/l的na2hpo4和nah2po4的缓冲液，ph值为7.4。

9、优选的，所述琼脂糖采用精确称取1g琼脂糖加入100ml蒸馏水中，摇匀，120℃高压灭菌20min，冷却后凝固。

10、优选的，所述尿激酶标准液的制备：取尿激酶玻瓶1只，根据其酶活标注单位大小，采用pbs缓冲液稀释，逐级制备100u/ml、500u/ml、1000u/ml、2000u/ml、5000u/ml的尿激酶标准液。

11、优选的，所述牛纤维蛋白原液为称取0.2g牛纤维蛋白原加入180ml的pbs缓冲液中，搅拌溶解后备用。

12、优选的，所述凝血酶溶液采用取凝血酶试剂用pbs缓冲液稀释至100u/ml，摇匀后备用。

13、优选的，所述牛纤维蛋白原液与凝血酶溶液的配比为15:1。

14、与现有技术相比，本发明具有以下优点：采用较少的牛纤维蛋白原和凝血酶原料，制备厚度完全一致的纤维平板，提高了单板的测试数量和数据的准确度，同时可以广泛应用于所有透明圈平板的方法测试，不但节约原料成本、简单易操作，而且提升了测试结果的精准度，便于推广应用。

技术特征：

1.一种纳豆激酶活性平板，其特征在于，包括：底板、盖板和塑料盒；所述底板和盖板的一侧边缘处对齐，并设有方向向上的预留缺口，且所述底板和盖板呈倾斜状态放置在塑料盒中。

2.一种根据权利要求1所述的纳豆激酶活性平板的使用方法，其特征在于，包括以下步骤：

3.根据权利要求2所述的一种纳豆激酶活性平板的使用方法，其特征在于：所述缓冲液为0.2mol/l的na2hpo4和nah2po4的缓冲液，ph值为7.4。

4.根据权利要求2所述的一种纳豆激酶活性平板的使用方法，其特征在于：所述琼脂糖采用精确称取1g琼脂糖加入100ml蒸馏水中，摇匀，120℃高压灭菌20min，冷却后凝固。

5.根据权利要求2所述的一种纳豆激酶活性平板的使用方法，其特征在于：所述尿激酶标准液的制备：取尿激酶玻瓶1只，根据其酶活标注单位大小，采用pbs缓冲液稀释，逐级制备100u/ml、500u/ml、1000u/ml、2000u/ml、5000u/ml的尿激酶标准液。

6.根据权利要求2所述的一种纳豆激酶活性平板的使用方法，其特征在于：所述牛纤维蛋白原液为称取0.2g牛纤维蛋白原加入180ml的pbs缓冲液中，搅拌溶解后备用。

7.根据权利要求2所述的一种纳豆激酶活性平板的使用方法，其特征在于：所述凝血酶溶液采用取凝血酶试剂用pbs缓冲液稀释至100u/ml，摇匀后备用。

8.根据权利要求2所述的一种纳豆激酶活性平板的使用方法，其特征在于：所述牛纤维蛋白原液与凝血酶溶液的配比为15:1。

技术总结
本发明涉及生物检测技术领域，尤其涉及一种纳豆激酶活性平板及其使用方法。包括：底板、盖板和塑料盒；所述底板和盖板的一侧边缘处对齐，并设有方向向上的预留缺口，且所述底板和盖板呈倾斜状态，预装纤维蛋白平板的成分；点样后，再平放在塑料盒中，保持恒温；本发明可以一板多样本测试，降低试剂的用量和成本，并且有效提高纤溶酶活性的测定精准度，适用性广。

技术研发人员：董超
受保护的技术使用者：河北省科学院生物研究所
技术研发日：
技术公布日：2024/3/27